Translocase of outer mitochondrial membrane 34 (TOMM34) orchestrates heat shock protein 70 (HSP70)/HSP90-mediated transport of mitochondrial precursor proteins. Here, using in vitro phosphorylation and refolding assays, analytical size-exclusion chromatography, and hydrogen/deuterium exchange MS, we found that TOMM34 associates with 14-3-3 proteins after its phosphorylation by protein kinase A (PKA). PKA preferentially targeted two serine residues in TOMM34: Ser93 and Ser160, located in the tetratricopeptide repeat 1 (TPR1) domain and the interdomain linker, respectively. Both of these residues were necessary for efficient 14-3-3 protein binding. We determined that phosphorylation-induced structural changes in TOMM34 are further augmented by binding to 14-3-3, leading to destabilization of TOMM34's secondary structure. We also observed that this interaction with 14-3-3 occludes the TOMM34 interaction interface with ATP-bound HSP70 dimers, which leaves them intact and thereby eliminates an inhibitory effect of TOMM34 on HSP70-mediated refolding in vitro In contrast, we noted that TOMM34 in complex with 14-3-3 could bind HSP90. Both TOMM34 and 14-3-3 participated in cytosolic precursor protein transport mediated by the coordinated activities of HSP70 and HSP90. Our results provide important insights into how PKA-mediated phosphorylation and 14-3-3 binding regulate the availability of TOMM34 for its interaction with HSP70.
- MeSH
- DNA vazebné proteiny genetika metabolismus MeSH
- fosforylace fyziologie MeSH
- lidé MeSH
- MFC-7 buňky MeSH
- mitochondriální membrány metabolismus MeSH
- mitochondriální proteiny metabolismus MeSH
- molekulární chaperony metabolismus MeSH
- proteinkinasy závislé na cyklickém AMP metabolismus MeSH
- proteiny 14-3-3 metabolismus MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP70 metabolismus MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP72 metabolismus MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP90 metabolismus MeSH
- signální transdukce MeSH
- transkripční faktory genetika metabolismus MeSH
- transportní proteiny mitochondriální membrány genetika metabolismus MeSH
- vazba proteinů MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Eukaryotic protein homeostasis (proteostasis) is largely dependent on the action of highly conserved Hsp70 molecular chaperones. Recent evidence indicates that, apart from conserved molecular allostery, Hsp70 proteins have retained and adapted the ability to assemble as functionally relevant ATP-bound dimers throughout evolution. Here, we have compared the ATP-dependent dimerization of DnaK, human stress-inducible Hsp70, Hsc70 and BiP Hsp70 proteins, showing that their dimerization propensities differ, with stress-inducible Hsp70 being predominantly dimeric in the presence of ATP. Structural analyses using hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, native electrospray ionization mass spectrometry and small-angle X-ray scattering revealed that stress-inducible Hsp70 assembles in solution as an antiparallel dimer with the intermolecular interface closely resembling the ATP-bound dimer interfaces captured in DnaK and BiP crystal structures. ATP-dependent dimerization of stress-inducible Hsp70 is necessary for its efficient interaction with Hsp40, as shown by experiments with dimerization-deficient mutants. Moreover, dimerization of ATP-bound Hsp70 is required for its participation in high molecular weight protein complexes detected ex vivo, supporting its functional role in vivo As human cytosolic Hsp70 can interact with tetratricopeptide repeat (TPR) domain containing cochaperones, we tested the interaction of Hsp70 ATP-dependent dimers with Chip and Tomm34 cochaperones. Although Chip associates with intact Hsp70 dimers to form a larger complex, binding of Tomm34 disrupts the Hsp70 dimer and this event plays an important role in Hsp70 activity regulation. In summary, this study provides structural evidence of robust ATP-dependent antiparallel dimerization of human inducible Hsp70 protein and suggests a novel role of TPR domain cochaperones in multichaperone complexes involving Hsp70 ATP-bound dimers.
- MeSH
- adenosintrifosfát metabolismus MeSH
- fyziologický stres MeSH
- HEK293 buňky MeSH
- krystalografie rentgenová MeSH
- lidé MeSH
- maloúhlový rozptyl MeSH
- molekulární modely MeSH
- multimerizace proteinu MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP70 chemie metabolismus MeSH
- transportní proteiny mitochondriální membrány metabolismus MeSH
- ubikvitinligasy metabolismus MeSH
- vazba proteinů MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Východiska: Proteom eukaryotické buňky představuje komplexní systém, jehož složky jsou vystaveny nepříznivým vlivům vnitřního a vnějšího prostředí. Funkce buněčného proteomu je tudíž závislá na existenci kompenzačních mechanizmů udržujících vnitřní proteinovou homeostázu – proteostázu. K těmto mechanizmům náleží síť molekulárních chaperonů a transkripční program řídící jejich syntézu. Proces kancerogeneze je provázen výraznými změnami faktorů vnitřního prostředí nádorových buněk – teplota, pH, dostupnost živin. Tyto změny představují na jedné straně důsledek deregulovaného růstu nádorové tkáně a na straně druhé mohou být zdrojem selekčního tlaku, který umožňuje vznik rezistentních a agresivních populací nádorových buněk. Popis složek proteostatického aparátu a mechanizmus jejich zapojení ve vývoji nádorové tkáně jsou předmětem tohoto přehledového článku. Cíl: Tento přehledový článek se věnuje popisu dvou kauzálně propojených skupin proteostatických dějů, jejichž vzájemná koordinace je klíčová pro průběh odpovědi nádorové buňky a potažmo i celé nádorové tkáně na environmentální i vnitřní stresové faktory. První skupina těchto dějů je zastoupena „vykonavatelskou“ úlohou molekulárních chaperonů z rodiny HSP70, HSP90 a tzv. malých molekulárních chaperonů. Tyto proteiny se podílejí na udržování stability buněčných proteinů nezbytných pro regulaci proliferace, apoptózy, senescence, migrace a fenotypové plasticity nádorových buněk. K druhé skupině popisovaných dějů pak náleží posttranslační řízení „systémové“ úlohy transkripčního faktoru HSF1 při regulaci exprese genů pro molekulární chaperony a dalších genů specificky regulovaných tímto transkripčním faktorem v nádorových a stromálních buňkách.
Background: The proteome of eukaryotic cells represents a complex system. Its components are exposed to various intrinsic and extrinsic stresses. Therefore, the function of the cellular proteome is dependent on the existence of compensatory mechanisms balancing the inner protein homeostasis – proteostasis. These mechanisms involve the network of molecular chaperones and transcriptional program regulating their expression. The process of cancerogenesis is accompanied by significant changes in the intracellular milieu of cancer cells – temperature, pH, availability of nutrients. On the one hand, these changes represent a consequence of the deregulated growth of the tumor tissue; on the other hand, they can be a source of selection pressure, which allows the emergence of resistant and aggressive tumor cell populations. Description of the proteostatic apparatus components and the mechanism of their involvement in the tumor tissue development is provided in this review article. Aim: This review focuses on the description of two causally linked groups of proteostatic events; their mutual coordination is crucial to the process of tumor cell and by extension the entire tumor tissue response to environmental and internal stress factors. The first group of these processes is represented by the “executory” role of molecular chaperones from HSP70, HSP90 and so-called small molecular chaperone protein families. These proteins are involved in maintaining stability of cellular proteins essential for proliferation, apoptosis, senescence, migration and phenotypic plasticity of tumor cells. The second group of the described processes comprises the posttranslational control of the “systemic” role of the transcription factor HSF1 in regulating the gene expression of molecular chaperones and other genes specifically regulated by this transcription factor in the tumor and stromal cells.
- MeSH
- lidé MeSH
- molekulární chaperony MeSH
- nádory * patologie MeSH
- poruchy proteostázy MeSH
- transkripční faktory metabolismus MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
Maintenance of protein homeostasis by molecular chaperones Hsp70 and Hsp90 requires their spatial and functional coordination. The cooperation of Hsp70 and Hsp90 is influenced by their interaction with the network of co-chaperone proteins, some of which contain tetratricopeptide repeat (TPR) domains. Critical to these interactions are TPR domains that target co-chaperone binding to the EEVD-COOH motif that terminates Hsp70/Hsp90. Recently, the two-TPR domain-containing protein, Tomm34, was reported to bind both Hsp70 and Hsp90. Here we characterize the structural basis of Tomm34-Hsp70/Hsp90 interactions. Using multiple methods, including pull-down assays, fluorescence polarization, hydrogen/deuterium exchange, and site-directed mutagenesis, we defined the binding activities and specificities of Tomm34 TPR domains toward Hsp70 and Hsp90. We found that Tomm34 TPR1 domain specifically binds Hsp70. This interaction is partly mediated by a non-canonical TPR1 two-carboxylate clamp and is strengthened by so far unidentified additional intermolecular contacts. The two-carboxylate clamp of the isolated TPR2 domain has affinity for both chaperones, but as part of the full-length Tomm34 protein, the TPR2 domain binds specifically Hsp90. These binding properties of Tomm34 TPR domains thus enable simultaneous binding of Hsp70 and Hsp90. Importantly, we provide evidence for the existence of an Hsp70-Tomm34-Hsp90 tripartite complex. In addition, we defined the basic conformational demands of the Tomm34-Hsp90 interaction. These results suggest that Tomm34 represents a novel scaffolding co-chaperone of Hsp70 and Hsp90, which may facilitate Hsp70/Hsp90 cooperation during protein folding.
- MeSH
- aminokyselinové motivy MeSH
- HEK293 buňky MeSH
- kvarterní struktura proteinů MeSH
- lidé MeSH
- missense mutace MeSH
- multiproteinové komplexy * chemie genetika metabolismus MeSH
- mutageneze cílená MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP70 * chemie genetika metabolismus MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP90 * chemie genetika metabolismus MeSH
- sbalování proteinů * MeSH
- substituce aminokyselin MeSH
- terciární struktura proteinů MeSH
- transportní proteiny mitochondriální membrány * chemie genetika metabolismus MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Nuclear factors of activated T-cells (NFATs) are important regulators of the cytokine gene expression in activated T-cells. In the last decade, NFATs have been shown to regulate cell cycle, differentiation and apoptosis in cells of various origins revealing their importance for cell homeostasis. In this study, we investigated the effects of NFAT1 on proliferation and differentiation of v-myb-transformed BM2 monoblasts. In contrast to many other leukemic cell lines, BM2 cells do not respond to retinoic acid. However, once overexpressing NFAT1, they became sensitive to all-trans retinoic acid (ATRA). The ATRA-treated BM2NFAT1 cells differentiated along monocyte/macrophage pathway as evidenced by changes in cell morphology, adherence, phagocytic and non-specific esterase activities, reactive oxygen species production, and vimentin expression. Furthermore, overexpressed NFAT1 either alone or in combination with the ATRA-driven signalling pathway deregulated cyclin A and retinoic acid receptor proteins in BM2 cells. Data presented in this study indicate that the NFAT1 and ATRA signalling pathways synergize in control of proliferation and differentiation of BM2 monoblasts.
- MeSH
- aktivace transkripce MeSH
- aktivní transport - buněčné jádro MeSH
- buněčná diferenciace MeSH
- cyklin A metabolismus MeSH
- fagocytóza MeSH
- interakce mezi receptory a ligandy MeSH
- ionomycin farmakologie MeSH
- kultivované buňky MeSH
- lidé MeSH
- onkogenní proteiny v-myb fyziologie MeSH
- prekurzorové buňky monocytů-makrofágů fyziologie MeSH
- proliferace buněk MeSH
- receptory kyseliny retinové metabolismus MeSH
- respirační vzplanutí MeSH
- transkripční faktory NFATC fyziologie MeSH
- tretinoin farmakologie fyziologie MeSH
- vápníková signalizace MeSH
- vápníkové ionofory farmakologie MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
V průběhu své syntézy i po jejím dokončení jsou buněčné proteiny vystavovány vnějším i vnitřním faktorům způsobujícím jejich poškození. Nefunkční či nesprávně složené proteiny představují přímé fyziologické riziko pro vysoce komplexní buněčné prostředí a musejí být efektivně odstraňovány. U eukaryotních buněk se vyvinulo několik mechanizmů kontroly proteinové kvality zajišťujících proteinovou homeostázu. Významnou roli hrají tyto mechanizmy v nádorových buňkách, u nichž genetická nestabilita spolu s nepříznivým prostředím nádorové tkáně vede ke zvýšené produkci poškozených nebo deregulovaných proteinů. Kontrola kvality proteinů zahrnující rovněž degradaci nádorových supresorů a onkoproteinů tak představuje důležitý proces provázející vznik a vývoj nádoru. V tomto souhrnném článku se zaměřujeme na popis tří hlavních buněčných mechanizmů kontroly kvality proteinů se zvláštním ohledem na jejich úlohu v kancerogenezi.
Both nascent and mature proteins are prone to damaging changes induced by either external or internal stimuli. Dysfunctional or misfolded proteins cause direct physiological risk in crowded cellular environment and must be readily and efficiently eliminated. To ensure protein homeostasis, eukaryotic cells have evolved several protein quality control machineries. Protein quality control plays a special role in cancer cells. Genetic instability causing increased production of damaged and/or deregulated proteins is a hallmark of cancer cells. Therefore, intrinsic genetic instability together with hostile tumour microenvironment represents a demanding task for protein quality control machineries in tumours. Regulation of general protein turnover as well as degradation of tumour-promoting/suppressing proteins by protein quality control machineries thus represent an important processes involved in cancer development and progression. The review focuses on the description of three major protein quality control pathways and their roles in cancer.
- Klíčová slova
- endoplasmatické retikulum,
- MeSH
- autofagie * fyziologie genetika MeSH
- degradace proteinů v endoplasmatickém retikulu * MeSH
- endoplazmatické retikulum fyziologie MeSH
- lidé MeSH
- nádorová transformace buněk MeSH
- nádorový supresorový protein p53 MeSH
- poškození DNA MeSH
- proteiny buněčného cyklu MeSH
- protoonkogenní proteiny c-mdm2 MeSH
- receptory autokrinního motilitního faktoru MeSH
- transport proteinů fyziologie MeSH
- ubikvitinace * fyziologie MeSH
- ubikvitinligasy MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
