The discovery of modulators that target cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein has opened the era of CF curative treatment. Although this therapy is termed mutation specific, strikingly a level of therapeutic response differs among patients with the identical CFTR genotype. We presume that the therapeutic response is also affected by non-CFTR genes, called disease modifying. Responsiveness of a CF patient to the modulator therapy is being investigated in vitro by using a intestinal organoids that are obtained from rectal biopsies. The proposed project aims to set organoids from the Czech CF patients who carry the most common CFTR genotype. Modifying genes that can contribute to individualised response will be selected on the grounds of changes in transcriptomic profiles which will be generated from organoids at the extremes of responses to the stimultation with CFTR modulators. Genotyping of SNPs in these genes will follow. The project output is to use organoids and modifying gene genotypes to identify suitable subjects for particular modulator therapy.

Objev modulátorů, které cílí na transmembránový regulátor vodivosti asociovaný s cystickou fibrózou (CFTR), otevřel etapu kauzální léčby CF. I když se tato terapie nazývá mutačně specifická, liší se míra odpovědi na léčbu i mezi těmi pacienty, kteří mají identický CFTR genotyp. Lze tak předjímat, že odpověď k léčbě ovlivňují ještě další geny nad rámec genu CFTR, tzv. geny modifikující onemocnění. Zda bude konkrétní pacient reagovat na léčbu modulátory CFTR, se zkouší in vitro predikovat na modelu intestinálních organoidů, získaných z rektálních biopsií. Navrhovaný projekt počítá s přípravou organoidů od českých pacientů s CF, kteří nesou nejčastější CFTR genotyp. Modifikující geny, které se mohou podílet na individualizované odpovědi k léčbě, vytipujeme na základě rozdílů v transkriptomových profilech, jež budou generovány z organoidů reagujících nejlépe a nejhůře na stimulaci CFTR modulátory. Dále srovnáme polymorfismy těchto genů. Výstupem projektu bude stratifikace pacientů coby vhodných kandidátů k dané léčbě na základě organoidů i znalosti genotypu modifikujících genů.

• Klíčová slova
• cystická fibróza, cystic fibrosis, organoidy, léky modulující CFTR, organoids, CFTR modulator drugs, modifikující geny, modifying genes,

• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

An early diagnosis of cystic fibrosis (CF) through newborn screening programmes (NBSP) is very important to initiate the treatment, genetic counseling, and specialized medical services. NBSP consists of immunoreactive trypsinogen (IRT) analysis, DNA analysis and sweat test. Sweat test is a golden standard, but many patients fall into the inconclusive diagnosis (CFSPID) due to the intermediate chloride levels (30-60 mmol/L) and unclear DNA analysis. We propose the validation of an improved method, based on non-invasive skin wipe sampling and analysis of all ions in the samples. We propose the use of ion ratios of selected ions (Cl-, K+, Na+, HCO3-) as a relevant diagnostic parameter and aim at evaluation of sensitivity, selectivity and repeatability of the method. We further propose creation of a ion ratio database of a large cohort of subjects during the NBSP as well as adult CF patients and controls to identify possible correlations between the type of mutation, severity and other symptoms with data obtained from the skin wipe samples to improve classification of CF patients.

Diagnóza cystické fibrózy (CF) novorozeneckým screeningem je důležitá, protože umožňuje včasné zahájení léčby, genetického poradenství a specializované terapie. Novorozenecký screening se skládá z analýzy imunoreaktivního trypsinogenu (IRT), genetické analýzy DNA a obsahu chloridů pomocí potního testu. Potní test je považován za tzv. zlatý standard v diagnostice CF. Výsledky potního testu v tzv. šedé zóně (Cl-: 30-60 mmol/L) a genetické analýzy ovšem někdy vedou k nejednoznačnému diagnostickému závěru (CFSPID). V tomto projektu navrhujeme validaci nové metody analýzy potu, založené na neinvazivním, rychlém a jednoduchém stěru předloktí. Ve vzorku budou analyzovány poměry vybraných iontů (Cl-, K+, Na+, HCO3-) které mají významný potenciál pro zlepšení diagnostiky CF. Je plánováno na statisticky významném souboru pacientů a zdravých kontrol vyhodnotit důležité parametry (citlivost, specificita, opakovatelnost, atd.) a vytvořit databázi iontových poměrů , určení korelace s typem genetické mutace, vážností onemocnění a dalšími symptomy, umožňujícímu zlepšení klasifikace CF pacientů.

• MeSH
• chloridy MeSH
• cystická fibróza diagnóza   MeSH
• genetické testování MeSH
• ionty MeSH
• klinické chemické testy MeSH
• novorozenec MeSH
• novorozenecký screening MeSH
• pot MeSH
• reprodukovatelnost výsledků MeSH
• Check Tag
• novorozenec MeSH

• Konspekt
• Pediatrie
• NLK Obory
• perinatologie a neonatologie
• genetika, lékařská genetika
• pneumologie a ftizeologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

The most problematic respiratory pathogens in patients with cystic fibrosis (CF) are arguably bacteria from Burkholderia cepacia complex (Bcc) as they cause fatal infections, untreatable by current antibiotics. Recently, first promising compounds with a therapeutic potential against Bcc have been discovered, yet underlying molecular processes of their interaction with bacterial cells have not been addressed. The project objectives are to describe inhibitory effect of novel compounds on the transcriptomic level (molecules 11026103 and 10126109 and combination of lactoferrin with hypothiocyanite), to identify targets for 11026103 and 10126109, in relation to variable susceptibility to characterize genome changes introduced over the course of infections with Bcc strain ST32 (dominant among Czech CF patients) and to identify a genotype of resistant ST32 clones. The whole genome sequencing and RNA-seq will be utilized for comparative genomics of ca. 50 longitudinal CF isolates and to describe cellular processes in association with exposure to novel antimicrobial compounds, respectively.

Mezi nejnebezpečnější respirační patogeny patří u pacientů s cystickou fibrózou (CF) bakterie z komplexu Burkholderia cepacia (Bcc), které způsobují fatální infekce, současnými antibiotickými přípravky neléčitelné. První nadějné látky s terapeutickým potenciálem proti Bcc byly nedávno objeveny, ale molekulární procesy blíže určující interakci těchto látek s bakteriální buňkou zůstávají neznámé. Předmětem projektu je popsat na úrovni transkriptomu inhibiční efekt nových antimikrobních preparátů (molekuly 11026103 a 10126109 a kombinace laktoferrinu s hypothiokyanátem), nalézt cílovou strukturu pro 11026103 a 10126109, ve vztahu k rozdílům v citlivosti vůči 4 novým látkám charakterizovat změny v genomu vzniklé v průběhu dlouhodobé infekce u kmene Bcc ST32, který je mezi pacienty s CF v ČR nejzastoupenější, a určit případný genotyp rezistentních klonů ST32. Metody celogenomového sekvenování a RNA-Seq budou užity k porovnání genomů cca 50 longitudinálních izolátů CF a k popisu buněčných procesů odehrávajících se v souvislosti s expozicí novým antimikrobním preparátům.

• MeSH
• antibakteriální látky terapeutické užití   MeSH
• Burkholderia cenocepacia MeSH
• cystická fibróza MeSH
• genom MeSH
• infekce bakteriemi rodu Burkholderia terapie   MeSH
• sekvenční analýza MeSH
• transkriptom MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• genetika, lékařská genetika
• bakteriologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

Early identification of infectious agents is still an unmet need in microbiological diagnostics especially for patients with life threatening infections. Downside of standard culture based methods is their inherent time delay; in addition they may fail in fastidious organisms or in a patient on antibiotic therapy. The aim of the project is to evaluate usefulness of the latest molecular genetic methods where one expects they solve the drawbacks of cultivation in emergency situations. We will focus on diagnostics of bloodstream infections in high risk haematooncological patients and on identification of causes of infective endocarditis, frequently culture negative. We will utilize a cutting edge technology of electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS). Microorganism identification via pathogen-specific PCR will be applied to other clinically serious situations in paediatrics where culture diagnostics is suboptimal: pneumococcal pneumonia, herpesviral encephalitis and re-emerging pertussis. Detection will be carried out in a closed system with DNA extraction and real time PCR.

Požadavek časné identifikace infekčních agens zůstává v mikrobiologické diagnostice výzvou zvláště u pacientů, jež infekce ohrožuje na životě. Standardní postupy založené na kultivaci jsou zatíženy časovou prodlevou, navíc mohou selhat u obtížně kultivovatelných agens či u pacienta na antibiotické léčbě. Cílem projektu je zhodnotit úspěšnost nejnovějších molekulárně genetických metod, u nichž se předpokládá, že řeší nedostatky kultivace v klinicky vypjatých situacích. Zaměříme se na diagnostiku infekcí krevního řečiště u vysoce rizikových hematoonkologických pacientů a na identifikaci původců infekční endokarditidy, kultivačně často negativní. K tomu využijeme nejnovějšího postupu kombinace hmotnostní spektrometrie a ionizace produktů PCR elektrosprejem (ESI-MS). Identifikaci mikroorganismu cestou patogen-specifického PCR zvolíme pro další klinicky významné situace v pediatrii, kde je kultivační diagnostika suboptimální: pneumokoková pneumonie, herpesvirová encefalitis a znovu se objevující pertuse. Detekce bude probíhat v uzavřeném systému s extrakcí DNA a PCR v reálném čase.

• MeSH
• bakteriální infekce diagnóza   MeSH
• časná diagnóza MeSH
• endokarditida MeSH
• hematologické nádory MeSH
• herpetická encefalitida diagnóza   MeSH
• hmotnostní spektrometrie s elektrosprejovou ionizací MeSH
• kritický stav MeSH
• nemoci cév diagnóza   MeSH
• pertuse diagnóza   MeSH
• pneumonie pneumokoková MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• infekční lékařství
• mikrobiologie, lékařská mikrobiologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

Informační brožura pro děti s cystickou fibrózou o základních hygienických pravidlech.

• MeSH
• cystická fibróza MeSH
• environmentální zdraví MeSH
• hygiena MeSH
• infekce spojené se zdravotní péčí prevence a kontrola   MeSH
• kontrola infekčních nemocí MeSH
• Publikační typ
• populární práce MeSH

• Konspekt
• Hygiena. Lidské zdraví
• NLK Obory
• pneumologie a ftizeologie
• hygiena
• NLK Publikační typ
• literatura pro děti a mládež

The newly developed molecular methods for direct detection of S. aureus, MRSA, small colony variants (SCV) of S. aureus and SCV-MRSA and special culture methods will be used for repeat analyses of clinical specimens from CF patients (about 300 strains per year). The molecular diagnostic and typing methods will be helpful not only in direct detection and clonal characterization of the pathogen but also in the analysis of resistance (resistance determinants, hypermutator phenotype) and virulence (superantigens, the pvl gene). The obtained results and their interpretation will be vital for tailored treatment of CF patients. The analysis of intracellular persistence of strains and their in vitro susceptibility to bacteriophages, with emphasis on SCV and SCV-MRSA strains, will be a point of departure for the development of candidate phage therapy in CF patients.

Nově zavedenými molekulárními metodami na přímý průkaz infekcí S. aureus, MRSA, small colny variants (SCV) S. aureus a SCV-MRSA a speciálními kultivačními metodami opakovaně vyšetříme klinický materiál pacientů s CF (ročně zhruba 300 kmenů). Nově zavedené molekulárně diagnostické a typizační metody umožní přímý průkaz a klonální charakterizaci patogena, ale i analýzu rezistence (determinanty rezistence, hypermutatorový typ rezistence) a virulence (superantigeny, gen pvl). Aplikace těchto progresivních metod a interpretace jejich výsledků poslouží k přímé racionalizaci léčby konkrétních pacientů s CF. Analýza intracelulární perzistence a citlivosti kmenů k bakteriofágům, s důrazem na SCV a SCV-MRSA, in vitro vytvoří předpoklady pro další studium specifické fagoterapie u pacientů s CF.

• MeSH
• cystická fibróza komplikace   mikrobiologie   MeSH
• diagnostické techniky molekulární MeSH
• methicilin rezistentní Staphylococcus aureus MeSH
• molekulární biologie MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• stafylokokové infekce MeSH
• Staphylococcus aureus patogenita   MeSH

• Konspekt
• Mikrobiologie
• NLK Obory
• bakteriologie
• genetika, lékařská genetika
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

The project will analyze Burkholderia cenocepacia transcriptome which is produced specifically at the final stage of the infection in patients with cystic fibrosis. To mimic conditions in vivo, clinical isolates of two epidemic B. cenocepacia strains will be incubated in medium containing either sputum or serum/whole blood that are collected at the stage of clinically stable infection or cepacia syndrome. Changes in gene expression will be analyzed using DNA arrays; at least 6 biological replicates for each condition studied will be processed. An expression level of candidate genes (ca. 6-8) and their specific expression at cepacia syndrome will be determined by RT-PCR from other sputa representing different stages of infection (200-300 sputa). A role of selected genes in pathogenesis of the infection will be further studied on bacterial mutants (this is not an inherent part of the project; will be investigated in laboratories abroad).

Projekt je zaměřen na analýzu transkriptomu Burkholderia cenocepacia, který mikroorganismus produkuje specificky v terminální fázi infekce pacientů s cystickou fibrózou. K napodobení situace in vivo budou klinické izoláty dvou epidemických kmenů B. cenocepacia inkubovány v mediu obsahujícím buď sputum, nebo sérum/plnou krev, které jsou odebrané ve fázi stabilní infekce a při cepacia syndromu. Změny v genové expresi budou hodnoceny pomocí DNA čipů na základě zpracování alespoň 6 biologických replikátů pro každou podmínku. Míra exprese kandidátních genů (cca 6-8), resp. jejich specifická exprese při cepacia syndromu bude určena RT-PCR analýzou z dalších sput, které reprezentují rozdílné fáze infekce (200 až 300 sput). Kompletní informace o roli vybraných genů v patogenezi infekce bude získána díky testování mutovaných bakterií in vivo (není přímou součástí grantu; bude odesláno k řešení do zahraniční laboratoře).

• MeSH
• Burkholderia cenocepacia patogenita   MeSH
• cystická fibróza komplikace   MeSH
• faktory virulence MeSH
• infekce bakteriemi rodu Burkholderia MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí MeSH
• sekvenční analýza hybridizací s uspořádaným souborem oligonukleotidů MeSH
• stanovení celkové genové exprese MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• infekční lékařství
• genetika, lékařská genetika
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

Toxigenic Cd is currently a significant nosocomial pathogen. Globally, the incidence and severity of infections caused by these bacteria has been growing in recent years, while the situation has worsened in some regions of the CR as well. However, complete data on the current situation are not available. The project is focused on the collection of clinically significant Cd and their molecular analysis using PCR ribotyping and MLVA. Expected to test at least 200 strains of Cd. Sensitivity of the antibiotics of choice - metronidazole,vancomycin and fidaxomicin will be determined. It is expected that bacterial cultures will be obtained by means of cooperation with at least ten hospital laboratories from different locations. The obtained data will serve to acquire a overview of the current epidemiological situation and they will also contribute to an effective therapy and control of the disease in our country. The project can serve as a model for a strategy of monitoring this problem in the future.

Toxigenní Clostridium difficile (Cd) je významný nozokomiální patogen současnosti. Incidence a závažnost infekcí vyvolaných touto bakterií v posledních letech globálně narůstá. K výraznému zhoršení situace dochází i v řadě regionů v ČR. Ucelená data o aktuální situaci ale nejsou k dispozici. Projekt se zaměřuje na sběr klinicky významných izolátů Cd a jejich molekulární analýzu s využitím PCR ribotypizace a MLVA. Předpokládá se vyšetření minimálně 200 kmenů Cd. U všech kmenů bude dále stanovena citlivost k antibiotikům volby- metronidazolu, vankomycinu případně fidaxomicinu. Při získávání bakteriálních kultur a základních informací se předpokládá se spolupráce s minimálně deseti nemocničními laboratořemi z různých lokalit. Získaná data budou sloužit k získání reprezentativního přehledu o aktuální epidemiologické situaci a přispějí k efektivní terapii a kontrole závažné infekce na našem území. Projekt může sloužit jako model pro strategii sledování tohoto problému i v budoucnosti.

• MeSH
• bakteriální léková rezistence MeSH
• Clostridioides difficile účinky léků   MeSH
• epidemiologie MeSH
• infekce spojené se zdravotní péčí MeSH
• mikrobiální testy citlivosti MeSH
• multilokusová sekvenční typizace MeSH
• ribotypizace MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

• Konspekt
• Biochemie. Molekulární biologie. Biofyzika
• NLK Obory
• biologie
• epidemiologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

Over the project period, approximately 1000 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa recovered from 110 patients with cystic fibrosis (CF) and ca 700 isolates of Burkholderia cepacia complex from 80 CF patients will be genotyped by using RAPD and PFGEmethods. A subsequent analysis of typing results will reveal if our CF population is at risk of epidemic outbreak and will determine an extent and character of infection control measures to be applied in the CF centre. Selected clinical samples will bealso tested by MLST to get unambiguous strain identification and the modified MLST method will be used for typing of positive samples which are negative by culture. Second part of the project will be dedicated to the genome comparison between epidemic and non-transmissible strains (on DNA arrays) and will indicate what genes are associated with the bacterial capability of spreading within a population. Microarray analysis will lead to designing a PCR for epidemic strain detection.

Za dobu trvání projektu bude podrobeno typizaci pomocí metod RAPD a PFGE zhruba 1000 klinických izolátů Pseudomonas aeruginosa získaných od 110 pacientů s cystickou fibrózou (CF) a cca 700 izolátů komplexu Burkholderia cepacia od 80 nemocných CF. Následná analýza výsledků typizace stanoví, zdali je naše populace pacientů s CF v ohrožení epidemického šíření infekce, a určí míru a charakter protiepidemických opatření v centru CF. Vybrané klinické vzorky budou též testovány metodou MLST k jednoznačné identifikaci kmene a upravená metoda MLST bude použita pro typizaci vzorků, u nichž se pozitivita nedaří potvrdit kultivačně. Druhá část projektu bude věnována porovnání genomu mezi epidemickými a nepřenosnými kmeny (na DNA čipech), která upřesní, jaké geny mohou být asociovány se schopností bakterií šířit se v populaci, a dovolí navrhnout PCR k detekci konkrétních kmenů.

• MeSH
• Burkholderia cepacia komplex MeSH
• cystická fibróza MeSH
• kontrola infekce MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   využití   MeSH
• Pseudomonas aeruginosa MeSH
• sekvenční analýza DNA MeSH
• srovnávací genomová hybridizace MeSH
• techniky typizace bakterií MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

• Konspekt
• Biochemie. Molekulární biologie. Biofyzika
• NLK Obory
• epidemiologie
• pneumologie a ftizeologie
• biologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

The effective treatment of infection with Pseudomonas aeruginosa in patients with cystic fibrosis requires early pathogen detection. Highly sensitive detection of the P.aeruginosa using nested PCR will be the indication to start an antibiotic therapy. The benefit from novel therapeutic protocol will be evaluated by comparison with clinical and microbiological data of historical controls (2001-2004). Their sputa will be retrospectively examined for the presence of P.aeruginosa using novel PCR. The potential occurrence of transmissible strain of P.aeruginosa in a cohort of our patients with cystic fibrosis will be checked using two genotyping techniques: RAPD and macrorestriction typing with subsequent PFGE.

Efektivní léčba infekce Pseudomonas aeruginosa u pacientů s cystickou fibrózou vyžaduje její časnou diagnostiku. Velmi citlivý přímý průkaz patogenu pomocí nested PCR bude indikací k zahájení antibiotické léčby. Prospěch z nového léčebného protokolu budestanoven porovnáním s klinickými daty historických kontrol (2001 až 2004) a s jejich mikrobiologickými výsledky, jež budou doplněné o retrospektivní PCR vyšetření sputa na přítomnost P.aeruginosa. Existence přenosného kmene P.aeruginosa v komunitě pacientů s cystickou fibrózou bude zjišťována pomocí dvou genotypizačních technik: RAPD a makrorestrikční typizace s využitím PFGE.

• MeSH
• antibakteriální látky normy   MeSH
• cystická fibróza komplikace   MeSH
• genetická predispozice k nemoci MeSH
• polymerázová řetězová reakce využití   MeSH
• pseudomonádové infekce farmakoterapie   epidemiologie   MeSH
• Pseudomonas aeruginosa MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• pediatrie
• genetika, lékařská genetika
• infekční lékařství
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR