Vývoj rekombinantních terapeutických protilátek je v poslední době jednou z nejrychleji se rozvíjejících disciplín aplikovaného biomedicínského výzkumu. Rekombinantní monoklonální protilátky nalézají stále větší uplatnění v biologické terapii řady závažných lidských chorob a jsou v současné době nenahraditelnou součástí komplexní protinádorové terapie. Terapeutické protilátky využívané v klinické praxi prošly značným vývojem. Z prvních protilátek produkovaných v myších, které jako vedlejší účinek indukovaly silnou imunitní odpověď, byly metodami rekombinantní DNA a genové manipulace vyvinuty plně lidské protilátky s výrazně omezenými vedlejšími účinky a zároveň se zvýšenou specifitou a efektivitou. V této práci jsou shrnuty základní poznatky o terapeutických monoklonálních protilátkách, jejich historický vývoj a přehled metodických přístupů vedoucích k vývoji účinnějších, ale také bezpečnějších protilátek.
Development of recombinant therapeutic antibodies is recently one of the fastest growing disciplines of applied biomedical research. Recombinant monoclonal antibodies are increasingly applied in biological therapy of many serious human diseases and are currently an irreplaceable part of a comprehensive cancer therapy. First mouse therapeutic antibodies had only limited applicability due to the strong immune response; however, technological advances enabled engineering of antibodies with increased specificity and efficacy, and on the other hand with reduced adverse effects due to lower antigenicity. This review provides a summary of knowledge about recombinant therapeutic antibodies, their mechanism of action and approaches how to improve their efficacy. Key words: antineoplastic agents – immunoglobulins – humanized monoclonal antibodies – therapeutic antibodies – recombinant antibodies This study was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101), MEYS – NPS I – LO1413 and MH CZ – DRO (MMCI, 00209805). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 20. 4. 2015 Accepted: 26. 6. 2015
- Klíčová slova
- terapeutické protilátky, protinádorová léčiva,
- MeSH
- farmaceutická chemie * MeSH
- humanizované monoklonální protilátky * chemie MeSH
- imunoglobuliny genetika MeSH
- lidé MeSH
- monoklonální protilátky dějiny chemie MeSH
- nádory farmakoterapie MeSH
- protilátky genetika MeSH
- protinádorové látky * MeSH
- rekombinantní DNA MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
Metody exprese a purifikace rekombinantních proteinů umožňují produkci a detailní charakterizaci proteinů v základním výzkumu během in vitro experimentů, ale také přípravu proteinů s terapeutickým využitím. Publikace shrnuje základní postupy od přípravy expresních vektorů až po techniku afinitní purifikace. Dále pojednává o vlastnostech různých prokaryotických a eukaryotických expresních systémů a možnostech jejich využití. Molekulární klonování, které slouží k přípravě expresních vektorů pro rekombinantní proteiny, umožňuje cíleně modifikovat vlastnosti těchto proteinů tak, aby byla usnadněna jejich purifikace a také pozměněna jejich stabilita, aktivita nebo funkce. V současné době je k dispozici široká škála metodických přístupů, jež umožňují rychlou a efektivní přípravu expresních vektorů. Zvolený produkční organizmus a způsob purifikace rekombinantního proteinu určují výběr expresního vektoru. První volbou často bývá expresní systém využívající bakterii Escherichia coli, jehož přednostmi jsou zejména technická, časová i finanční nenáročnost. Tento expresní systém není příliš vhodný pro produkci komplexních savčích proteinů, pro které jsou optimální expresní systémy založené na využití eukaryotických organizmů (kvasinky, hmyzí buňky nebo savčí buňky). Kultivace hmyzích a savčích buněk je však technicky i finančně náročná. Rekombinantní proteiny jsou purifikovány nejčastěji metodou afinitní chromatografie využívající specifickou interakci peptidu nebo proteinu s afinitní matricí. Tyto peptidy či proteiny jsou fúzovány s N‑ nebo C‑koncem purifikovaného proteinu. Purifikace probíhá ve třech krocích, kdy je rekombinantní protein prostřednictvím afinitních značek specificky zachycen na matrici chromatografické kolony, dále následuje promývací krok, po kterém je uvolněn z kolony čistý protein.
Production of recombinant proteins is essential for many applications in both basic research and also in medicine, where recombinant proteins are used as pharmaceuticals. This review summarizes procedures involved in recombinant protein expression and purification, including molecular cloning of target genes into expression vectors, selection of the appropriate expression system, and protein purification techniques. Recombinant DNA technology allows protein engineering to modify protein stability, activity and function or to facilitate protein purification by affinity tag fusions. A wide range of cloning systems enabling fast and effective design of expression vectors is currently available. A first choice of protein expression system is usually the bacteria Escherichia coli. The main advantages of this prokaryotic expression system are low cost and simplicity; on the other hand this system is often unsuitable for production of complex mammalian proteins. Protein expression mediated by eukaryotic cells (yeast, insect and mammalian cells) usually produces properly folded and posttranslationally modified proteins. However, cultivation of insect and, especially, mammalian cells is time consuming and expensive. Affinity tagged recombinant proteins are purified efficiently using affinity chromatography. An affinity tag is a protein or peptide that mediates specific binding to a chromatography column, unbound proteins are removed during a washing step and pure protein is subsequently eluted. Key words: recombinant protein – molecular cloning – purification – expression system This work was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) and by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 22. 1. 2014 Accepted: 20. 3. 2014
- Klíčová slova
- purifikace, expresní systém, expresní vektor,
- MeSH
- chromatografie afinitní MeSH
- Escherichia coli genetika MeSH
- eukaryotické buňky MeSH
- exprese genu * MeSH
- genetická transkripce MeSH
- genetické vektory * MeSH
- klonování DNA * MeSH
- kultivační média MeSH
- kvasinky genetika MeSH
- prokaryotické buňky MeSH
- proteinové inženýrství MeSH
- rekombinantní proteiny * genetika chemická syntéza MeSH
- virové proteiny genetika MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Activation of the Hsp90 chaperone system is a characteristic of cancer cells. The regulation of chaperone activities involves their interaction with cochaperones; therefore we investigated the expression of Hsp70 and Hsp90 and their specific co-chaperones HOP and CHIP in cancer cell lines and primary cancers. Inhibition of Hsp90 by 17AAG increased the levels of Hsp70, Hsp90 and HOP but not CHIP mRNA in cancer cells. These changes are linked to activation of the HSF1 transcription factor and we show that the HOP promoter contains HSF1 binding sites, and that HSF1 binding to the HOP promoter is increased following 17AAG. The lack of alteration in the co-chaperone CHIP is explained by a lack of HSF response elements in the CHIP promoter. Non-proliferating cells expressed higher levels of CHIP and lower HOP, Hsp70 and Hsp90 levels compared to proliferating cells. Decreased expression of CHIP in proliferating cancer cells is in keeping with its proposed tumor suppressor properties, while over-expression of HOP in proliferating cells may contribute to excessive Hsp90 activity and stabilization of client proteins in tumors. In a panel of colorectal cancer samples, increased expression of Hsp70 and an increased ratio of HOP to CHIP were found, and were associated with decreased median survival. These data indicate that multiple changes occur in the chaperone/co-chaperone system in cancer that impact patient survival. It is likely that the ability to identify individual alterations to this system will be beneficial for treatment strategy decisions, particularly those that employ chaperone inhibitors.
- MeSH
- benzochinony farmakologie MeSH
- DNA vazebné proteiny genetika metabolismus MeSH
- HCT116 buňky MeSH
- homeodoménové proteiny genetika metabolismus MeSH
- Kaplanův-Meierův odhad MeSH
- lidé MeSH
- makrocyklické laktamy farmakologie MeSH
- nádorové supresorové proteiny genetika metabolismus MeSH
- nádory tračníku metabolismus MeSH
- prognóza MeSH
- proliferace buněk účinky léků MeSH
- promotorové oblasti (genetika) účinky léků MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP70 genetika metabolismus MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP90 antagonisté a inhibitory genetika metabolismus MeSH
- regulace genové exprese u nádorů účinky léků MeSH
- responzivní elementy genetika MeSH
- transkripční faktory genetika metabolismus MeSH
- ubikvitinligasy genetika metabolismus MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Molekulární chaperony jsou proteiny, které se podílejí na vytváření a udržování správné konformace ostatních proteinů v buňce. Vážou se na nově syntetizované nebo denaturované polypeptidové řetězce, aktivně mění jejich konformaci a podílejí se na jejich transportu nebo degradaci. Chaperony hrají velmi důležitou roli v nádorové buňce, kde jejich zvýšená aktivita umožňuje stabilizovat řadu mutantních proteinů a překonávat stres vzniklý genetickou nestabilitou. Klíčovým chaperonem nádorových buněk je Hsp90, mezi jehož klienty náleží receptory růstových faktorů, steroidních hormonů a signální proteiny, z nichž řada patří mezi cíle protinádorové terapie. Nepříznivé podmínky mikroprostředí nádoru, jako jsou hypoxie a nedostatek živin, přispívají ke zvýšené destabilizaci proteinů, čímž závislost na chaperonech ještě dále prohlubují. Z těchto důvodů představují molekulární chaperony, a zvláště Hsp90, nadějný cíl protinádorové terapie. Hsp90 je dále výjimečný tím, že v nádorových buňkách vykazuje výrazně vyšší citlivost k inhibitorům oproti normálním buňkám a inhibice Hsp90 v nádorech vede k paralelnímu potlačení různých drah onkogenní signalizace. V současné době probíhají klinické testy několika inhibitorů Hsp90 a jsou stále identifikovány nové látky s různým mechanizmem účinku.
Molecular chaperones help other proteins to achieve and maintain their proper conformation. Chaperones bind to newly synthesized or unfolded polypeptide chains, actively modify their conformation and participate on their transport or degradation. Chaperones play an important role in cancer cell, where their increased activity enables stabilization of many mutant proteins and overcoming the stress generated by genetic instability. Hsp90 represents a key chaperone in cancer cells. Growth factor receptors, steroid hormone receptors and signal proteins are among its substrates, so-called client proteins; many of them being targets for anticancer therapy. Adverse conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia and nutrient deficiency, contribute to destabilization of proteins and further escalate dependence on chaperones. This is why molecular chaperones, in particular Hsp90, may represent a promising target for anticancer therapy. Importantly also, tumour-based Hsp90 has a significantly higher sensitivity to inhibitors than that in normal cells, and Hsp90 activity inhibition in tumours leads to a suppression of cellular signaling in many different oncogenic pathways. Several inhibitors of Hsp90 are currently undergoing clinical evaluation and new agents with different mechanisms of action are continually being identified.
- Klíčová slova
- nádorová onemocnění,
- MeSH
- financování organizované MeSH
- lidé MeSH
- molekulární chaperony antagonisté a inhibitory fyziologie MeSH
- nádory patofyziologie MeSH
- proteiny tepelného šoku HSP90 antagonisté a inhibitory fyziologie MeSH
- protinádorové látky terapeutické užití MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
