Hlavní nevýhodou běžně používaných nativních trombocytů je krátká doba použití, která obvykle nepřesahuje 5 dní. Může tak docházet k jejich omezené dostupnosti. Kryokonzervace trombocytů umožňuje prodloužení doby skladování trombocytových transfuzních přípravků až na 2 roky, pokud jsou uchovávány při teplotě –80 °C. Fakultní nemocnice Brno zavedla metodu kryokonzervace trombocytů při –80 °C v 5–6% roztoku dimethylsulfoxidu. K mražení jsou využívány směsné trombocyty z buffy-coatu krevní skupiny 0, které jsou po rozmražení rekonstituovány pomocí náhradního roztoku SSP+. Autoři předkládají výsledky srovnávací studie kryokonzervovaných a nativních trombocytů, která předcházela uvedení nových produktů do klinické praxe. Byly hodnoceny tyto parametry: obsah a koncentrace trombocytů, pH, objem, ztráta trombocytů během mražení, obsah dimethylsulfoxidu, obsah reziduální plazmy, obsah celkového proteinu, titr AB0 protilátek a swirling. Viskoelastické vlastnosti byly měřeny rotační tromboelastografií a obsah trombocytárních mikropartikulí byl stanoven pomocí průtokového cytometru. Vyrobené kryokonzervované trombocyty dosahují předepsaných kvalitativních parametrů a zachovávají si průměrně 83,6 % původního obsahu trombocytů. Zanedbatelný obsah reziduální plazmy vede k nízkému obsahu celkové bílkoviny (0,3 g/terapeutickou dávku) a k velmi nízkému titru AB0 protilátek (0–2). Kryokonzervované trombocyty krevní skupiny 0 rekonstituované pomocí SSP+ lze proto považovat za AB0 univerzální produkty, a to i pro klinické stavy, při kterých jsou vyžadovány promyté trombocyty. Kryokonzervované trombocyty vykazují zkrácení doby vzniku koagula a 25× vyšší obsah trombocytárních mikropartikulí ve srovnání s nativními krevními destičkami. Tyto vlastnosti spolu s dlouhou dobou použitelnosti předurčují využití kryokonzervovaných trombocytů zejména v urgentních stavech provázených masivním krvácením.
The main disadvantage of fresh platelets is their short shelf life, usually 5 days, which can result in their restricted availability. Platelet cryopreservation extends shelf life up to 2 years when stored at a temperature of –80 °C. University Hospital Brno has implemented a method of platelet freezing at –80 °C in 5–6% dimethyl sulfoxide. Buffy-coat-derived leucodepleted blood group 0 fresh platelets are used for cryopreservation and reconstituted in platelet additive solution SSP+ after thawing. The authors present the results of a comparative study of cryopreserved and fresh buffy-coat-derived leucodepleted platelets going prior to clinical application. The following parameters were determined: platelet count and concentration, pH, volume, platelet loss, dimethyl sulfoxide content, plasma content, total protein content, ABO antibody titre and swirling. Viscoelastic properties were evaluated via rotational thromboelastometry and platelet microparticle numbers were measured by flow cytometry. Cryopreserved platelets met the required quality parameters and maintained an 83.6% pre-freeze platelet count. The very low plasma content resulted in a low total protein content (0.3 g/unit) and very low ABO antibody titre (0–2). Cryopreserved blood group O platelets reconstituted in SSP+ may thus be considered to be universal ABO products, even in clinical situations where washed platelets are required. Cryopreserved platelets showed faster clot initiation and the number of platelets microparticles increased 25 times compared to fresh platelets. These properties and the long shelf life predestine the use of cryopreserved platelets in urgent situations involving massive bleeding.
- Klíčová slova
- kryokonzervované trombocyty, směsné trombocyty, náhradní roztok pro trombocyty,
- MeSH
- dimethylsulfoxid MeSH
- konzervace krve * metody MeSH
- kryoprezervace metody MeSH
- lidé MeSH
- trombocyty MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
Cíl práce: Práce se zabývá klinickou částí výzkumu lidských embryonálních kmenových buněk (hESC). Cílem projektu je vznik somatických buněčných typů použitelných ve vývoji léčiv, regenerativní medicíně a buněčné terapii. Výhledem je umožnit cílenou terapii dosud nevyléčitelné nemoci. Pluripotentní hESC mají neomezenou kapacitu pro sebeobnovu. Této vlastnosti se využívá v terapii, kdy jsou z hESC vytvořeny chybějící nebo poškozené buňky v lidském těle. Je zájem vytvořit hESC linie v klinické kvalitě, použitelné v předklinických a klinických studiích. Metodika: Vytvoření hESC musí respektovat legislativu ČR a EU. Podmínkou bylo vypracovat informovaný souhlas obou dárců pro darovaná vyřazená embrya, která nejsou vhodná pro léčbu oplodněním in vitro dle směrnice 2004/23/ES. Centrum asistované reprodukce (CAR) FN Brno se podílí na odběru oocytů, kultivaci a kryokonzervaci embryí, komunikaci s klienty a zajišťování informovaných souhlasů dárců embryí. Byl vypracován předávací protokol a metodika předávání rozmrazených embryí s originálním číselným kódem. Před předáním embryí na spoluautorské pracoviště – Centrum buněčného a tkáňového inženýrství (CTEF) ICRC FN u sv. Anny – je provedeno jejich rozmrazení, v případě potřeby dokultivování do stadia blastocysty, a následně je proveden asistovaný hatching. Výsledky: V období leden 2018 až červenec 2020 bylo obesláno 138 vybraných vhodných klientek na dárcovství, z nichž 52 nereagovalo, 19 ukončilo a 29 prodloužilo skladování embryí. Pouze 38 klientek, tj. 27,5 %, souhlasilo s jejich využitím na přípravu hESC. Ve stejném období probíhala osobní komunikace s vhodnými klienty CAR a bylo získáno dalších 17 dárců embryí. Celkem bylo získáno 160 embryí od 55 dárkyň ve věku 26–42 let. Nejčastěji byla embrya zamrazena ve stadiu blastocysty (53 embrií – 33,1 %) a moruly (74 embrií – 46,3 %). Z 29 geneticky vyšetřených embryí je 5 euploidních (17,2 %), 2 mozaiky a 22 aneuploidních nebo s translokací či přenašečů s monogenní vadou. Závěr: Byl vypracován a Etickou komisí LF MU a FN Brno schválen informovaný souhlas, bylo vybráno a zajištěno 160 darovaných embryí. Je vypracován předávací protokol a metodika předávání. Plán předávání rozmrazených anonymizovaných embryí zahrnuje cca 5 rozmrazených blastocyst týdně s provedeným asistovaným hatchingem. Po předání embryí na CTEF probíhá izolace embryoblastu s následnou kultivací. Ustanovené buněčné linie hESC musí splnit specifikovaná kritéria bezpečnosti, stability a pluripotence. Věříme, že v souladu s plánem projektu získáme nejméně tři linie hESC v klinické kvalitě, poprvé vytvořené v ČR, respektující požadavky na léčivé přípravky Advanced Medicinal Therapy Products (AMTP).
Objective: The work deals with a clinical part of human embryonic stem cell (hESC) research. The aim of the project is the differentiation of somatic cell types, useful in drug development, regenerative medicine and cell therapy. The aim of this work is to enable targeted therapy of yet incurable diseases. The pluripotent hESCs have unlimited self-renewal capacity. This ability is used in therapy to create missing or damaged cells in the human body. It is of interest to develop clinical-grade hESC lines useful in preclinical and clinical studies. Methods: The derivation of the hESC must respect the legislation of the Czech Republic and the EU. The aim was to develop an informed consent of both donors for donated discarded embryos that are not suitable for treatment by in vitro fertilization according to Directive 2004/23/EC. The FNB‘s Center for Assisted Reproduction (CAR) participates in oocyte collection, cultivation and cryopreservation of embryos, communication with clients and ensuring the informed consent of embryo donors. A transport protocol and a methodology for handing over the thawed embryos with the original numerical code were developed. Before the embryos are handed over to the ICRC co-author‘s workplace (CTEF), they are thawed and, if necessary, recultivated to the blastocyst stage; afterwards, assisted hatching is performed. Results: In the period from January 2018 to July 2020, 138 selected suitable clients were asked for donations, with 52 not responding, 19 terminating and 29 extending the embryo storage. Only 38 clients, i.e. 27.5%, agreed with the usage of their embryos for the preparation of hESCs. In the same period, personal communication with suitable CAR clients took place and another 17 embryo donors were obtained. A total of 160 embryos were obtained from 55 donors aged 26 to 42 years. The embryos were most often frozen in the blastocyst (53 embryos – 33.1%) and morula (74 embryos – 46.3%) stages. Of the 29 genetically examined embryos, only 5 are euploid (17.2%), 2 are mosaic and 22 are aneuploid or with translocations or carriers with a monogenic defect. Conclusion: We have an informed consent prepared and approved by the Ethics Committee of the Masaryk University and the University Hospital Brno; 160 donated embryos have been selected and secured. A transport protocol and handover methodology are developed. The plan for the transfer of thawed anonymized embryos in the first phase, October – December 2020, includes approximately 5 thawed blastocysts per week with assisted hatching. After their transfer to the CTEF, the embryoblast will be isolated with subsequent cultivation. The established hESCs must meet the specified criteria of safety, stability and pluripotency. We believe that, in accordance with the project plan, we will obtain at least 3 clinical-grade hESC lines, the first created in the Czech Republic, respecting the requirements for Advanced Medicinal Therapy Products (AMTP).
- Klíčová slova
- výběr embryí,
- MeSH
- blastocysta MeSH
- buněčná a tkáňová terapie MeSH
- embryoblast MeSH
- lidé MeSH
- lidské embryonální kmenové buňky MeSH
- nakládání s embryem * MeSH
- vitrifikace MeSH
- získávání tkání a orgánů MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- abstrakt z konference MeSH
Závěrečná zpráva o řešení grantu Interní grantové agentury MZ ČR
Přeruš. str. : il., tab. ; 30 cm
The aim is to confirm or deny the hypothesis that insulin affects diffusion capacity of lungs, probably due to an increased fluid capacity of alveolar capillaries. Simultaneously the microarray technology will be used to map the impact of insulin on transcriptomes of lung parenchyma and two cell lines. The results of this work should above all improve breathing in patients after lung resection.
Cílem je potvrdit nebo vyvrátit hypotézu, že inzulín ovlivňuje difúzní kapacitu plic a to pravděpodobně díky zvýšení kapacity alveolárních kapilár. Zároveň bude pomocí microarrays mapován účinek inzulínu na transkriptom plicního parenchymu i dvou buněčných linií. Výsledky práce by měly především zlepšit dýchání u pacientů po resekci plic.
- MeSH
- difuzní kapacita plic MeSH
- exprese genu MeSH
- hyperglykemie MeSH
- inzulin terapeutické užití MeSH
- mikročipová analýza MeSH
- nádorové buněčné linie MeSH
- plicní alveoly MeSH
- plicní surfaktanty MeSH
- pneumektomie MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí MeSH
- sekvenční analýza hybridizací s uspořádaným souborem oligonukleotidů MeSH
- Konspekt
- Biochemie. Molekulární biologie. Biofyzika
- NLK Obory
- onkologie
- biologie
- hematologie a transfuzní lékařství
- NLK Publikační typ
- závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR
The immune systems of multiple myeloma patients are suppressed by the disease itself, and this immunosuppression is further enhanced by standard therapies. The aim of our study was to evaluate the effects of initial chemotherapy and a peripheral blood mobilisation regimen on T-cell population diversity. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) with a new set of primers, in combination with capillary electrophoresis, was established. The methodology was used to analyse the relative expression of 27 T-cell receptor beta variable gene families (BV families) in multiple myeloma patients undergoing peripheral blood stem cell harvest. We found that the overall BV family usage in these patients was restricted; the relative expression of 10 BV families was significantly depressed in patients compared to healthy donors. These findings demonstrate that the preparative regimen for autologous stem cell transplantation affects the T-cell population in terms of the restriction of its T-cell receptor diversity.
- MeSH
- autologní transplantace škodlivé účinky MeSH
- DNA primery genetika MeSH
- dospělí MeSH
- elektroforéza kapilární MeSH
- exprese genu genetika imunologie MeSH
- farmakoterapie MeSH
- leukocyty mononukleární cytologie metabolismus MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mnohočetný myelom diagnóza farmakoterapie imunologie terapie MeSH
- nežádoucí účinky léčiv MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí MeSH
- receptory antigenů T-buněk alfa-beta genetika MeSH
- senioři nad 80 let MeSH
- senioři MeSH
- stanovení celkové genové exprese metody MeSH
- transplantace periferních kmenových buněk škodlivé účinky MeSH
- Check Tag
- dospělí MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- senioři nad 80 let MeSH
- senioři MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
CD34 is the most frequently used marker for the selection of cells for bone marrow (BM) transplantation. The use of CD133 as an alternative marker is an open research topic. The goal of this study was to evaluate the proliferation and differentiation potential for hematopoiesis (short and long term) of CD133+ and CD34+ populations from bone marrow and mobilized peripheral blood. Eight cell populations were compared: CD34+ and CD133+ cells from both the BM (CML Ph-, CML Ph+, and healthy volunteers) and mobilized peripheral blood cells. Multicolor flow cytometry and cultivation experiments were used to measure expression and differentiation of the individual populations. It was observed that the CD133+ BM population showed higher cell expansion. Another finding is that during a 6-day cultivation with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (CFSE), more cells remained in division D0 (non-dividing cells). There was a higher percentage of CD38- cells observed on the CD133+ BM population. It was also observed that the studied populations contained very similar but not the same pools of progenitors: erythroid, lymphoid, and myeloid. This was confirmed by CFU-GM and CFU-E experiments. The VEGFR antigen was used to monitor subpopulations of endothelial sinusoidal progenitors. The CD133+ BM population contained significantly more VEGFR+ cells. Our findings suggest that the CD133+ population from the BM shows better proliferation activity and a higher distribution of primitive progenitors than any other studied population.
- MeSH
- antigeny CD34 krev imunologie MeSH
- biologické markery metabolismus MeSH
- buněčná diferenciace imunologie MeSH
- buněčný rodokmen MeSH
- buňky kostní dřeně cytologie fyziologie MeSH
- CD antigeny krev imunologie MeSH
- glykoproteiny krev imunologie MeSH
- hematopoetické kmenové buňky cytologie fyziologie MeSH
- krevní buňky cytologie fyziologie MeSH
- kultivované buňky MeSH
- lidé MeSH
- peptidy krev imunologie MeSH
- proliferace buněk MeSH
- separace buněk MeSH
- vaskulární endoteliální růstový faktor A metabolismus MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Changes in nuclear architecture play an important role in the regulation of gene expression. The importance of epigenetic changes is observed during granulopoiesis, when changes in the nuclear architecture are considered a major factor that influences the downregulation of genes. We aimed to assess the influence of chromatin condensation on the regulation of gene expression during granulopoiesis. Based on a previously published microarray analysis, we chose loci with different levels of transcriptional activity during granulopoiesis. Fluorescent in situ hybridisation (FISH) and immunofluorescent labelling of RNA polymerase II were used to determine the relationship between the transcriptional activity of gene clusters and their localisation within areas with different levels of chromatin condensation. Although active loci were positioned outside of areas of condensed chromatin, downregulation of genes during granulopoiesis was not accompanied by a shift of the downregulated loci to condensed areas. Only the beta-globin cluster was subjected to chromatin condensation and localised to condensed areas. Our results indicate that granulopoiesis is accompanied by a non-random, tissue-specific pattern of chromatin condensation. Furthermore, we observed that the decrease in the quantity of RNA polymerase II correlates with the differentiation process and likely acts in synergy with chromatin condensation to downregulate total gene expression.
- MeSH
- beta-globiny biosyntéza MeSH
- down regulace fyziologie MeSH
- HL-60 buňky MeSH
- leukopoéza fyziologie MeSH
- lidé MeSH
- multigenová rodina fyziologie MeSH
- restrukturace chromatinu fyziologie MeSH
- sekvenční analýza hybridizací s uspořádaným souborem oligonukleotidů MeSH
- stanovení celkové genové exprese MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Isolation of granulocytes from blood is necessary for accurate study of changes in their expression. After gradient centrifugation, we obtain relatively pure granulocyte populations with different ratios of neutrophils and eosinophils. Unfortunately, in many studies in this field the expression results are not set according to the real variability of the granulocyte population. In many cases, the granulocyte population is marked simply as "neutrophils" and the residual population of eosinophils is not considered. Based on our recent study where we tracked the general transcription factor RNA polymerase II, we hypothesized that eosinophils are more transcriptionally active cells than neutrophils. We decided to test our hypothesis on isolated cells because its implications could change our view on many past expression analyses performed on granulocytes. In our experiments, we isolated neutrophils and eosinophils and measured their total RNA production. According to our results, eosinophils produce much more RNA than neutrophils. Therefore, relatively low numbers of highly active eosinophils can markedly affect the whole pool of granulocytic RNA. We want to emphasize that either a detailed description of the cell population or the use of a pure neutrophil population is necessary for the correct interpretation of neutrophil expression analysis results.
cDNA microarray technology is widely used in various biological and medical disciplines to determine gene expression profiles. Unfortunately, this technology requires a large quantity of input RNA. Since there is an increasing need for more precise analyses of defined cell subpopulations with low cell counts, working protocols using a minimal number of input cells are required. Optimal RNA isolation and its accurate amplification are crucial to the success of these protocols. The HL-60 cell line was used in the search for a suitable protocol that can be used for clinical samples of CD34+ haematopoietic cells obtained from bone marrow. The goal was to discover the best method for isolating and amplifying RNA from a small number of cells. Our evaluation of various methods and kits available in the market revealed that the combination of RNAqueous™ Kit for RNA isolation and the SenseAmp Plus Kit for one-round RNA amplification produced the best results. This article presents a verified protocol describing a reliable and reproducible method for obtaining enough input RNA for microarray experiments when the number of cells is limited.
