Non-invasive prenatal tests for the detection of fetal aneuploidies are predominantly based on the analysis of cell-free DNA (cfDNA) from the plasma of pregnant women by next-generation sequencing. The development of alternative tests for routine genetic laboratories is therefore desirable. Multiplex digital droplet PCR was used to detect 16 amplicons from chromosome 21 and 16 amplicons from chromosome 18 as the reference. Two fluorescently labeled lock nucleic acid probes were used for the detection of reaction products. The required accuracy was achieved by examining 12 chips from each patient using Stilla technology. The plasma cfDNA of 26 pregnant women with euploid pregnancies and 16 plasma samples from pregnancies with trisomy 21 were analyzed to determine the cutoff value for sample classification. The test was validated in a blind study on 30 plasma samples from pregnant patients with a risk for trisomy 21 ranging from 1:4 to 1:801. The results were in complete agreement with the results of the invasive diagnostic procedure (sensitivity, specificity, PPV, and NPV of 100%). Low cost, and speed of analysis make it a potential screening method for implementation into the clinical workflow to support the combined biochemical and ultrasound results indicating a high risk for trisomy 21.
- MeSH
- aneuploidie MeSH
- Downův syndrom * diagnóza genetika MeSH
- lidé MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
- prenatální diagnóza metody MeSH
- těhotenství MeSH
- trizomie MeSH
- volné cirkulující nukleové kyseliny * genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- těhotenství MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
In families with X-linked recessive diseases, foetal sex is determined prenatally by detection of Y-chromosomal sequences in cell-free foetal DNA (cffDNA) in maternal plasma. The same procedure is used to confirm the cffDNA presence during non-invasive prenatal RhD incompatibility testing but there are no generally accepted markers for the detection of cffDNA fraction in female-foetus bearing pregnancies. We present a methodology allowing the detection of paternal X-chromosomal alleles on maternal background and the confirmation of female sex of the foetus by positive amplification signals. Using digital droplet PCR (ddPCR) we examined X-chromosomal INDEL (insertion/deletion) polymorphisms: rs2307932, rs16397, rs16637, rs3048996, rs16680 in buccal swabs of 50 females to obtain the population data. For all INDELs, we determined the limits of detection for each ddPCR assay. We examined the cffDNA from 63 pregnant women bearing Y-chromosome negative foetuses. The analysis with this set of INDELs led to informative results in 66.67% of examined female-foetus bearing pregnancies. Although the population data predicted higher informativity (74%) we provided the proof of principle of this methodology. We successfully applied this methodology in prenatal diagnostics in a family with Wiscott-Aldrich syndrome and in pregnancies tested for the risk of RhD incompatibility.
- MeSH
- analýza určování pohlaví metody MeSH
- dospělí MeSH
- genetické testování MeSH
- lidé MeSH
- lidské chromozomy X genetika MeSH
- mutace INDEL * MeSH
- plod chemie metabolismus MeSH
- polymerázová řetězová reakce metody MeSH
- polymorfismus genetický * MeSH
- prenatální diagnóza metody MeSH
- těhotenství MeSH
- volné cirkulující nukleové kyseliny analýza genetika MeSH
- Check Tag
- dospělí MeSH
- lidé MeSH
- těhotenství MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- kazuistiky MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
PCR has become one of the most valuable techniques currently used in bioscience, diagnostics and forensic science. Here we review the history of PCR development and the technologies that have evolved from the original PCR method. Currently, there are two main areas of PCR utilization in bioscience: high-throughput PCR systems and microfluidics-based PCR devices for point-of-care (POC) applications. We also discuss the commercialization of these techniques and conclude with a look into their modifications and use in innovative areas of biomedicine. For example, real-time reverse transcription PCR is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnoses. It could also be used for POC applications, being a key component of the sample-to-answer system.
- MeSH
- Betacoronavirus genetika izolace a purifikace MeSH
- COVID-19 MeSH
- design vybavení MeSH
- klinické laboratorní techniky přístrojové vybavení metody MeSH
- koronavirové infekce diagnóza virologie MeSH
- lidé MeSH
- mikrofluidní analytické techniky přístrojové vybavení metody MeSH
- pandemie MeSH
- polymerázová řetězová reakce přístrojové vybavení metody MeSH
- SARS-CoV-2 MeSH
- testování na COVID-19 MeSH
- virová pneumonie diagnóza virologie MeSH
- vyšetření u lůžka MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- přehledy MeSH
Cíl studie: Rešerše současné literatury s cílem nalézt nové biomarkery, které by mohly v kombinaci se stávajícími metodikami přispět k včasnému záchytu preeklampsie. Pozornost byla věnována zejména biomarkerům detekovatelným metodami molekulární genetiky - mikroRNA (miRNA), dlouhým nekódujícím RNA (long non-coding RNA - lncRNA) a alteracím v metylacích promotorů genů, jejichž exprese je klíčová pro rozvoj PE. Typ studie: Review. Název a sídlo pracoviště: Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. Metodika: Rešerše článků obsažených v databázi PubMed publikovaných do března 2018. Výsledky: U pacientek, u nichž došlo k vývoji preeklampsie, byly opakovaně zjišťovány zvýšené hodnoty miR-210, miR-155, miR-16 a miR-181a. Nižší hodnoty než u kontrol byly naopak nalézány v případě miR-223. Exosomy představují jeden z hlavních zdrojů mikroRNA v krvi - mohou pocházet jak z placenty, tak z krevních buněk samotných. Mezi lncRNA byly vytypovány zejména na úrovni tkáně placenty jako vhodné molekuly k dalšímu studiu LOC391533, LOC284100, CEACAMP8, RPAIN, SPRY4-IT 1 a lncRNA Uc.187 se zvýšenou expresí a MEG3, STOX2-IT3, lncRNA-ATB a MALAT-1 s expresí sníženou. Alterace v metylaci promotorů rovněž na úrovni tkáně placenty byly nalezeny například u genů HLA-G, MTHFR, HERVWE 1, GNA12 nebo SERPINA3. Závěr: U všech výše zmíněných potenciálních biomarkerů lze nalézt jejich funkční vztah ke komplexnímu procesu etiopatogeneze PE. S ohledem na praktické využití se však jeví jako nejvhodnější pro rozšíření stávající palety biomarkerů miR-210 transportovaná v exozomech a vykazující zvýšené hladiny u PE v řadě dosavadních studií.
Objective: The review of recent literature performed with the goal to find novel biomarkers which would be able in combination with actual approaches to contribute to early pre-eclampsia (PE) detection. Attention has been paid namely to biomarkers which are detectable by methodologies of molecular genetics - microRNA (miRNA), long non-coding RNA (lncRNA) and alterations in methylation status of gene promoters with activities playing key roles in PE development. Design: Review. Setting: Department of Biology and Medical Genetics, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague. Methods: Review of articles in PubMed database published till March 2018. Results: In patients who developed PE, elevated levels of miR-210, miR-155, miR-16 and miR-181a were repeatedly detected. Lower values than in control subjects were found in miR-223. Exosomes represent one of the main sources of microRNA in blood - they may originate from placenta and also from blood cells themselves. Among lncRNAs at the level of placenta tissue, the following molecules for further study were selected: LOC391533, LOC284100, CEACAMP8, RPAIN, SPRY4-IT 1 and lncRNA Uc.187 with elevated expression and MEG3, STOX2-IT3, lncRNA-ATB and MALAT-1 with decreased expression. Alterations in promoter methylation were found also in placental tissue for examples in genes HLA-G, MTHFR, HERVWE 1, GNA12 or SERPINA3. Conclusion: For all above mentioned potential biomarkers, it was possible to find the functional links to the complex process of pathogenesis of PE. With regard to the practical use, miR-210 transported in exosomes and having elevated levels in PE patients seems to be most suitable for potential widening of the recent palette of biomarkers.
