Východiska: Cílem této práce je představit algoritmus separace plazmatických buněk ze vzorků kostní dřeně pacientů s mnohočetným myelomem. Zisk vysoce čistých buněčných populací je základní podmínkou aplikace moderních výzkumných postupů u tohoto onemocnění. Materiál a metody: Vzorky kostní dřeně byly získány od pacientů z Interní hematoonkologické kliniky FN Brno. Kostní dřeň byla nejprve zbavena červené složky (metodou hustotní gradientové centrifugace nebo lyzace), plazmatické buňky byly označeny monoklonální protilátkou proti syndecanu-1 (CD138) a separovány magneticky nebo na buněčném sorteru. Čistota separované populace byla vyhodnocena na průtokovém cytometru, případně morfologicky. Výsledky: Paralelně, magnetickou a fluorescenční separací, bylo zpracováno 28 vzorků kostní dřeně a byla vyhodnocena čistota separovaných frakcí. Na základě statistického hodnocení výsledných čistot jak v celém souboru vzorků, tak ve skupinách podle vstupního zastoupení plazmatických buněk byl navržen algoritmus separace s cut-off hodnotou 5 % plazmatických buněk v mononukleární frakci KD: vzorky s < 5 % plazmatických buněk jsou nadále tříděny na buněčném sorteru, vzorky s ? 5 % plazmatických buněk jsou separovány na magnetickém separátoru. Po ročním vyhodnocení uplatnění tohoto algoritmu na souboru 210 vzorků kostní dřeně se medián čistoty separovaných plazmatických buněk zvedl z 62,4 % (0,4–99,6 %) na 94,0 % (23,9–100 %). Závěr: Zavedení metodiky fluorescenčního třídění výrazně přispělo k celkovému zvýšení úspěšnosti separace plazmatických buněk ze vzorků kostní dřeně, a to především u vzorků s jejich nízkým vstupním zastoupením, kde dosud využívaná metodika magnetické separace není dostatečně účinná. Otevřela se tím také cesta k separaci plazmatických buněk ze vzorků kostní dřeně od jedinců s monoklonální gamapatií nejasného významu, kde je zastoupení plazmatických buněk typicky velmi nízké (desetiny, max. jednotky procent).
Backgrounds: The aim of this paper is to present an algorithm for plasma cell separation from bone marrow samples of multiple myeloma patients. The main prerequisite for applying modern research methods in this disease is gaining pure cell populations. Material and Methods: Bone marrow samples were collected from outpatients or inpatients of the Internal Haematology and Oncology Clinic of the Faculty Hospital Brno, after they had signed an Informed Consent Form. The bone marrow was first depleted of red cells (by density gradient centrifugation or erythrolysis), plasma cells were labelled by monoclonal antibody against syndecan-1 (CD138) and separated either magnetically or by cell sorter. The purity of separated population was evaluated by flow cytometry or, alternatively, morfologically. Results: We processed 28 bone marrow samples, in parallel, by magnetic or fluorescence-based separation, and we evaluated the purity of the separated fractions. Based on a statistical evaluation of resulting purities in the entire sample set as well as the individual groups divided according to the initial plasma cell content, a separation algorithm was proposed with a cut-off value of 5% of plasma cells in mononuclear fraction of bone marrow: samples with less than 5% of plasma cells are henceforth separated on cell sorter, samples with more than 5% are separated magnetically. The effectiveness of this algorithm was evaluated after the first year of its application on a dataset of 210 bone marrow samples: median purity of the separated plasma cells increased from 62.4% (0.4–99.6%) to 94.0% (23.9–100%). Conclusion: The introduction of a fluorescence-based separation markedly increased the effectiveness of plasma cell separation from bone marrow samples, mainly in samples with low plasma cell content where magnetic separation used thus far is not sufficient. This finding also opened a door for plasma cell separation of bone marrow samples from patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance, where plasma cell count is typically below or just over one percent.
- Klíčová slova
- magnetická separace, buněčný sorter,
- MeSH
- algoritmy MeSH
- financování organizované MeSH
- imunomagnetická separace MeSH
- kostní dřeň patologie MeSH
- lidé MeSH
- mnohočetný myelom patologie MeSH
- monoklonální gamapatie nejasného významu MeSH
- plazmatické buňky patologie MeSH
- průtoková cytometrie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
V našich laboratořích jsou plazmatické buňky (PB) ze vzorků aspiračních biopsií kostních dření pacientů nemocných mnohočetným myelomem (MM) separovány magneticky aktivovanou separací buněk (MACS) a/nebo fl uorescenčně aktivovanou separací buněk (FACS). Pro selekce se používají protilátky CD138 MACS MicroBeads nebo fl uorescenčně značené, které jsou namířeny proti povrchovému antigenu CD138 plazmatických buněk, známému jako syndecan-1. Izolované PB jsou využity pro molekulárně biologické studie k PCR analýze, ke komparativní genomické hybridizaci (CGH), fl uorescenční in situ hybridizaci (FISH), k proteinovým analýzám nebo k analýzám povrchových buněčných markerů či intracelulárních antigenů.
We have used magnetic-activated cell sorting (MACS) and/or fl uorescence-activated cell sorting (FACS) for the separation of plasma cells (PC) from bone marrow aspirates from patients with multiple myeloma (MM) using human antibodies CD138 MACS Micro-Beads or CD138-PE antibodies that recognize the plasma cell surface antigen CD138 (syndecan-1). Isolated PC can be used for molecular biology studies of MM such as PCR analysis, comparative genomic hybridization (CGH), fl uorescence in situ hybridization (FISH), protein analysis, analysis of cell surface markers, and/or intracellular antigens.
- Klíčová slova
- MicroBeads, pozitivní selekce, MultiSort strategie, depleční přístup,
- MeSH
- biopsie MeSH
- hematopoetické kmenové buňky * metabolismus MeSH
- imunomagnetická separace * metody MeSH
- kostní dřeň MeSH
- laboratoře MeSH
- lidé MeSH
- magnetické pole MeSH
- mnohočetný myelom MeSH
- odběr vzorku krve MeSH
- plazmatické buňky * MeSH
- průtoková cytometrie * metody MeSH
- separace buněk * metody MeSH
- syndekan-1 * MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
V této studii jsme srovnali dvě metodiky separace plazmatických buněk z kostní dřeně dostupné v současné době na našem pracovišti. Práce srovnává úspěšnost obou metodik v závislosti na vstupní infi ltraci a hodnotí i další aspekty separace buněk, jako je fi nanční a časová náročnost.
We have compared two different methods used for the isolation of plasma cells from the bone marrow. Our analysis focuses on the efficacy of either method for different plasma cell percentages in the bone marrow as well and on fi nancial and time requirements.
- Klíčová slova
- MicroBeads, pozitivní selekce, MultiSort strategie, depleční přístup, medián % plazmatických buněk (min-max), čistota pozitivních frakcí,
- MeSH
- biopsie MeSH
- hematopoetické kmenové buňky * metabolismus MeSH
- imunomagnetická separace * metody MeSH
- kostní dřeň MeSH
- laboratoře MeSH
- lidé MeSH
- magnetické pole MeSH
- mnohočetný myelom MeSH
- odběr biologického vzorku * metody MeSH
- odběr vzorku krve MeSH
- plazmatické buňky * MeSH
- průtoková cytometrie * metody MeSH
- separace buněk * metody MeSH
- statistika jako téma MeSH
- syndekan-1 * MeSH
- výzkumný projekt MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Východiska: Vícebarevná průtoková cytometrie je užitečným nástrojem k analýze plazmatických buněk, jelikož s dostatečnou senzitivitou dovoluje stanovení jejich počtu a zejména rozlišení na fyziologické a patologické. Typ studie a soubor: V této studii jsme sledovali zastoupení plazmocytů na souboru 25 pacientů s monoklonální gamapatií nejasného významu a 78 osob s mnohočetným myelomem, s cílem nalézt rozdíly v počtu a fenotypu jejich plazmocytů a případně také defi novat potenciální parametr, který by obě nemoci od sebe odlišil. Metody a výsledky: Flowcytometrická analýza plazmocytů byla prováděna ve vzorcích kostních dření s využitím povrchových markerů CD38, CD138, CD45, CD56 a CD19. Při srovnání s mnohočetným myelomem je pro monoklonální gamapatii nejasného významu příznačné vyšší zastoupení reziduálních CD19+ plazmocytů (p<0,001) a nižší zastoupení patologických CD56+ plazmocytů (p=0,004) v kostní dřeni. Závěry: Relativní počet CD19+ plazmocytů se jeví jako jednoznačný parametr pro odlišení monoklonální gamapatie nejasného významu od všech klinických stádií mnohočetného myelomu. Analýzou plazmocytů a jejich fenotypového profi lu můžeme napomoci při diferenciální diagnostice onemocnění. Do budoucna předpokládáme také možný význam analýzy plazmocytů v kostní dřeni pro prognózu hodnocených osob a pro studium minimální reziduální choroby.
Backgrounds: Multicolor fl ow cytometry is a sensitive tool for the analysis of plasma cell population. It can differentiate between normal and malignant plasma cells and enables their quantifi cation. Design and Subjects: We have used fl ow cytometry for quantifi cation and immunophenotyping of plasma cells from 25 patients with monoclonal gammopathy of undetermined signifi cance and 78 those with multiple myeloma aiming to identify and characterize markers that distinguish between the two conditions. Methods and Results: The expression of surface antigens CD38, CD138, CD45, CD56 and CD19 was analysed on bone marrow plasma cells. As compared to MM patients, MGUS patients had higher proportion of residual CD19+ plasma cells (p<0,001) and lower counts of pathologic CD56+ plasma cells (p=0,004) in the bone marrow. Conclusions: The number of CD19+ plasma cells appeared to be an unequivocal marker that distinguishes monoclonal gammopathy of unknown signifi cance from all stages of multiple myeloma. Immunophenotyping of plasma cell can thus contribute to the differential diagnosis of both diseases. It has also been suggested that flow cytometric analysis should be useful for prognostic evaluation and for the study of minimal residual disease.
- MeSH
- antigen CD56 MeSH
- antigeny CD19 MeSH
- exprese genu MeSH
- fenotyp MeSH
- kostní dřeň MeSH
- mnohočetný myelom genetika patologie MeSH
- monoklonální gamapatie nejasného významu genetika patologie MeSH
- monoklonální protilátky MeSH
- plazmatické buňky * cytologie fyziologie patologie MeSH
- průtoková cytometrie * využití MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- stupeň závažnosti nemoci MeSH
- výzkumný projekt MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
