Mitochondriální onemocnění jsou vyvolané nedostatečnou funkcí energetického aparátu a patří k závažným dědičným poruchám metabolismu. Řada kauzálních mutací již byla identifikována díky rozvoji exomového sekvenování, ale stále se nedaří nalézt genetickou příčinu u téměř 40% případů. Kvalitní neinvazivní biochemická charakterizace pacientů s podezdřením na mitochondriální onemocnění zásadní pro úspěšnou interpretaci exomových dat. Cílem projektu je využití krevních elementů jako materiálu pro standardizovanou a reprodukovatelnou biochemickou charakterizaci pacientů. Bude optimalizována metodika kryoprezervace krevních elementů kompatibilní s následnou analýzou mitochondriálních funkcí. Ty budou poté analyzovány pomocí vysoce citlivé respirometrie u permeabilizovaných buněk a analýzou preferovaných metabolických drah u buněk intaktních. U pacientů s biochemicky potvrzeným nálezem bude provedeno exomové sekvenování pro určení genetické příčiny a nově nalezené varianty budou dále funkčně validovány.; Mitochondrial diseases are caused by insufficient function of energy provision apparatus and they belong among the most severe inborn errors of metabolism. Whole exome sequencing helped to characterise many causal mutations, but as of yet, almost 40% of cases remain without defined genetic cause. Thorough non-invasive biochemical characterisation remains the centrepiece for successful interpretation of identified genetic variants. Aim of the project is to develop and optimise cryopreservation technique for blood elements, which will be compatible with subsequent functional analyses of mitochondrial function. Subsequently, they will be analysed through high resolution respirometry in permeabilised cells and by the analysis of preferred metabolic pathways in intact cells. In patients with biochemically verified mitochondrial dysfunction, causal genetic variant will be identified by exome sequencing and newly characterised variants will be functionally validated.

• Klíčová slova
• Metabolism, metabolizmus, oxidační fosforylace, Mitochondrie, oxidative phosphorylation, Mitochondria, mitochondriální onemocnění, Mitochondrial diseases,

• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

Dědičná deficience ATP syntázy, klíčového enzymu buněčné energetiky, patří mezi nejzávažnější metabolická onemocnění. Její nejčastější příčinou jsou mutace v genu asemblačního faktoru TMEM70. Možnosti terapeutického ovlivnění mitochondriálních onemocnění jsou v současnosti velmi omezené, kausální léčba zcela chybí. TMEM70 defekty jsou vhodnými kandidáty pro hledání nových terapií, neboť TMEM70 není absolutně nezbytný pro biogenezi ATP syntázy a lze očekávat, že k plnému obnovení ATP produkce dojde již po částečném zvýšení množství nově tvořeného enzymu. Cílem projektu je (i) identifikovat farmakologické aktivátory ATP syntázy na modelu buněk s delecí TMEM70 genu a následně validovat kandidátní látky na unikátním souboru linií fibroblastů od pacientů s TMEM70 mutací pro ověření jejich možné terapeutické využitelnosti, dále (ii) testovat možnost genetické komplementace defektu ATP syntázy u potkanů s knockoutem TMEM70 genu pomocí transgenní overexprese TMEM70 pod nepřirozeným promotorem. Zaměříme se na studium odpovědi pomocí komplexní fenotypizace od enzymu po celý organismus.; Inborn deficiency of ATP synthase, the key enzyme of cellular energy provision, belongs to the most severe metabolic diseases. The prevailing cause of this disease are mutation in the gene for specific assembly factor TMEM70. Present therapy for mitochondrial diseases is rather limited and causal treatment is missing. However, TMEM70 defects represent promising target for establishing of new therapy as it is not absolutely essential for ATP synthase biogenesis and sufficient recovery of ATP production can be expected even after partial increase of ATP synthase content. Our aim is to (i) identify pharmacological activators of ATP synthesis on a model of TMEM70 knockout cells and subsequently test candidate compounds on our unique collection of patients’ fibroblasts cell lines harbouring mutations in TMEM70 as a proof of principle for their utility. (ii) We will test the possibility to complement TMEM70 knockout in rats by transgenic overexpression of TMEM70 and perform complex phenotyping study of enzyme to organismal responses to the TMEM70 expression under non-natural promotor.

• MeSH
• krysa rodu rattus MeSH
• lidé MeSH
• mitochondriální nemoci farmakoterapie   genetika   MeSH
• mitochondriální protonové ATPasy genetika   nedostatek   MeSH
• modely nemocí na zvířatech MeSH
• mutace genetika   MeSH
• vzácné nemoci genetika   terapie   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• krysa rodu rattus MeSH
• lidé MeSH
• zvířata MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• genetika, lékařská genetika
• farmacie a farmakologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

Overproduction of reactive oxygen species (ROS) has been implicated in a range of pathologies. Mitochondrial flavin dehydrogenases glycerol-3-phosphate dehydrogenase (mGPDH) and succinate dehydrogenase (SDH) represent important ROS source, but the mechanism of electron leak is still poorly understood. To investigate the ROS production by the isolated dehydrogenases, we used brown adipose tissue mitochondria solubilized by digitonin as a model. Enzyme activity measurements and hydrogen peroxide production studies by Amplex Red fluorescence, and luminol luminescence in combination with oxygraphy revealed flavin as the most likely source of electron leak in SDH under in vivo conditions, while we propose coenzyme Q as the site of ROS production in the case of mGPDH. Distinct mechanism of ROS production by the two dehydrogenases is also apparent from induction of ROS generation by ferricyanide which is unique for mGPDH. Furthermore, using native electrophoretic systems, we demonstrated that mGPDH associates into homooligomers as well as high molecular weight supercomplexes, which represent native forms of mGPDH in the membrane. By this approach, we also directly demonstrated that isolated mGPDH itself as well as its supramolecular assemblies are all capable of ROS production.

• MeSH
• ferrikyanidy metabolismus   MeSH
• glycerolfosfátdehydrogenasa chemie   metabolismus   MeSH
• glycerolfosfáty metabolismus   MeSH
• krysa rodu rattus MeSH
• mitochondrie enzymologie   metabolismus   MeSH
• peroxid vodíku metabolismus   MeSH
• reaktivní formy kyslíku metabolismus   MeSH
• savci MeSH
• sukcinátdehydrogenasa chemie   metabolismus   MeSH
• transport elektronů * MeSH
• ubichinon metabolismus   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• krysa rodu rattus MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase (mGPDH) is not included in the traditional textbook schemes of the respiratory chain, reflecting the fact that it is a non-standard, tissue-specific component of mammalian mitochondria. But despite its very simple structure, mGPDH is a very important enzyme of intermediary metabolism and as a component of glycerophosphate shuttle it functions at the crossroads of glycolysis, oxidative phosphorylation and fatty acid metabolism. In this review we summarize the present knowledge on the structure and regulation of mGPDH and discuss its metabolic functions, reactive oxygen species production and tissue and organ specific roles in mammalian mitochondria at physiological and pathological conditions.

• MeSH
• alosterická regulace MeSH
• glycerolfosfátdehydrogenasa genetika   fyziologie   MeSH
• glykolýza MeSH
• lidé MeSH
• mastné kyseliny metabolismus   MeSH
• mitochondrie enzymologie   MeSH
• orgánová specificita MeSH
• oxidativní fosforylace MeSH
• reaktivní formy kyslíku metabolismus   MeSH
• sukcinátdehydrogenasa metabolismus   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

We investigated hydrogen peroxide production in mitochondria with low (liver, heart, brain) and high (brown adipose tissue, BAT) content of glycerophosphate dehydrogenase (mGPDH). ROS production at state 4 due to electron backflow from mGPDH was low, but after inhibition of electron transport with antimycin A high rates of mGPDH-dependent ROS production were observed in liver, heart and brain mitochondria. When this ROS production was related to activity of mGPDH, many-fold higher ROS production was found in contrast to succinate- (39-, 28-, 3-fold) or pyruvate plus malate-dependent ROS production (32-, 96-, 5-fold). This specific rate of mGPDH-dependent ROS production was also exceedingly higher (28-, 66-, 22-fold) compared to that in BAT. mGPDH-dependent ROS production was localized to the dehydrogenase+CoQ and complex III, the latter being the highest in all mitochondria but BAT. Our results demonstrate high efficiency of mGPDH-dependent ROS production in mammalian mitochondria with a low content of mGPDH and suggest its endogenous inhibition in BAT.

• MeSH
• antimycin A farmakologie   MeSH
• financování organizované MeSH
• glycerolfosfátdehydrogenasa metabolismus   MeSH
• hnědá tuková tkáň metabolismus   MeSH
• jaterní mitochondrie metabolismus   účinky léků   MeSH
• křečci praví MeSH
• krysa rodu rattus MeSH
• kyselina jantarová metabolismus   MeSH
• kyselina pyrohroznová metabolismus   MeSH
• mitochondrie metabolismus   účinky léků   MeSH
• mozek metabolismus   MeSH
• peroxid vodíku metabolismus   MeSH
• potkani Wistar MeSH
• reaktivní formy kyslíku metabolismus   MeSH
• respirační komplex III metabolismus   MeSH
• srdeční mitochondrie metabolismus   účinky léků   MeSH
• techniky in vitro MeSH
• transport elektronů MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• křečci praví MeSH
• krysa rodu rattus MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• zvířata MeSH

Isolated defects of mitochondrial ATPase due to diminished biosynthesis of the enzyme represent new class of severe mitochondrial diseases of nuclear origin. The primary cause of decreased cellular content of ATPase appears to be a problem in assembly of the F1 catalytic part of the enzyme. With the aim to elucidate how the low ATPase content affects mitochondrial energy provision and ROS production, we have investigated fibroblasts from patients with ATPase decrease to 10-30%. Measurements of cellular respiration showed pronounced decrease in ATPase capacity for basal respiration, mitochondrial ATP synthesis was decreased to 26-33%. Cytofluorometric analysis using TMRM revealed altered discharge of mitochondrial membrane potential (DeltaPsim) in patient cells, which was 20 mV increased at state 3-ADP. Analysis of ROS production by CM-H2DCFDA demonstrated 2-fold increase in ROS production in patient cells compared to controls. ROS production rate was sensitive to uncoupler (FCCP) and thus apparently related to increased DeltaPsim. Our studies clearly demonstrate that low ATPase content and decreased mitochondrial ATP production lead to high values of DeltaPsim and are associated with activation of ROS generation by the mitochondrial respiratory chain. In conclusion, both the energetic deprivation and increased oxidative stress are important components of the pathogenic mechanism of ATPase disorders.

• MeSH
• adenosintrifosfát biosyntéza   MeSH
• adenosintrifosfatasy * nedostatek   MeSH
• energetický metabolismus * MeSH
• kultivované buňky MeSH
• lidé MeSH
• membránové potenciály MeSH
• mitochondrie * metabolismus   MeSH
• reaktivní formy kyslíku * metabolismus   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH