Amplicon-based next-generation sequencing (NGS) of immunoglobulin (IG) and T-cell receptor (TR) gene rearrangements for clonality assessment, marker identification and quantification of minimal residual disease (MRD) in lymphoid neoplasms has been the focus of intense research, development and application. However, standardization and validation in a scientifically controlled multicentre setting is still lacking. Therefore, IG/TR assay development and design, including bioinformatics, was performed within the EuroClonality-NGS working group and validated for MRD marker identification in acute lymphoblastic leukaemia (ALL). Five EuroMRD ALL reference laboratories performed IG/TR NGS in 50 diagnostic ALL samples, and compared results with those generated through routine IG/TR Sanger sequencing. A central polytarget quality control (cPT-QC) was used to monitor primer performance, and a central in-tube quality control (cIT-QC) was spiked into each sample as a library-specific quality control and calibrator. NGS identified 259 (average 5.2/sample, range 0-14) clonal sequences vs. Sanger-sequencing 248 (average 5.0/sample, range 0-14). NGS primers covered possible IG/TR rearrangement types more completely compared with local multiplex PCR sets and enabled sequencing of bi-allelic rearrangements and weak PCR products. The cPT-QC showed high reproducibility across all laboratories. These validated and reproducible quality-controlled EuroClonality-NGS assays can be used for standardized NGS-based identification of IG/TR markers in lymphoid malignancies.
- MeSH
- akutní lymfatická leukemie genetika MeSH
- genetické markery genetika MeSH
- genová přestavba T-lymfocytů genetika MeSH
- geny pro imunoglobuliny genetika MeSH
- geny TcR genetika MeSH
- imunoglobuliny genetika MeSH
- lidé MeSH
- receptory antigenů T-buněk genetika MeSH
- referenční standardy MeSH
- rekombinace genetická genetika MeSH
- reprodukovatelnost výsledků MeSH
- reziduální nádor genetika MeSH
- výpočetní biologie metody MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Analysis and interpretation of Ig and TCR gene rearrangements in the conventional, low-throughput way have their limitations in terms of resolution, coverage, and biases. With the advent of high-throughput, next-generation sequencing (NGS) technologies, a deeper analysis of Ig and/or TCR (IG/TR) gene rearrangements is now within reach, which impacts on all main applications of IG/TR immunogenetic analysis. To bridge the generation gap from low- to high-throughput analysis, the EuroClonality-NGS Consortium has been formed, with the main objectives to develop, standardize, and validate the entire workflow of IG/TR NGS assays for 1) clonality assessment, 2) minimal residual disease detection, and 3) repertoire analysis. This concerns the preanalytical (sample preparation, target choice), analytical (amplification, NGS), and postanalytical (immunoinformatics) phases. Here we critically discuss pitfalls and challenges of IG/TR NGS methodology and its applications in hemato-oncology and immunology.
- MeSH
- alely MeSH
- genová přestavba MeSH
- geny pro imunoglobuliny MeSH
- geny TcR genetika MeSH
- hematologie metody MeSH
- imunogenetika metody normy MeSH
- imunologické techniky * MeSH
- lidé MeSH
- výpočetní biologie metody MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování * metody MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
Sledování hladiny minimální reziduální nemoci (MRN) má obrovský význam pro pacienta a často rozhoduje o jeho dalším osudu. U pacientů s hematologickými malignitami je sledování MRN již součástí léčebných protokolů, nicméně se ukazuje, že sledování MRN, někdy vyjadřované také jako cirkulující nádorové buňky nebo minimální diseminovaná nemoc, má význam i u pacientů se solidními nádory. Principem molekulárního sledování MRN je najít na nádorové buňce marker na DNA, RNA nebo proteinové úrovni, kterým se bude lišit od normálních buněk kostní dřeně a/nebo periferní krve a který bude možno detekovat s vysokou specifitou a senzitivitou pomocí molekulárních metod. Rozvoj kvantitativních metod detekce MRN nám umožňuje i vyjádřit se k případnému úbytku či nárůstu MRN. V přehledu je pojednáno o jednotlivých molekulárních metodikách detekce MRN, jejich úskalích, výhodách, limitacích a nárocích na vstupní materiál a zpracování. Také je uveden přehled molekulárních markerů hematologických i nehematologických onemocnění. Klíčová slova: minimální reziduální nemoc – minimální diseminovaná nemoc – cirkulující nádorové buňky – PCR – kvantitativní PCR – Ig/TCR přestavby
Minimal residual disease (MRD) monitoring is of a great importance for the patients and often determines their future therapy. At present, MRD detection in patients suffering from hematologic malignancies is included in most of treatment protocols. However, it appears that the MRD detection, sometimes described as circulating tumor cells or minimal disseminated disease, is important in patients with solid tumors as well. Molecular MRD monitoring principles include detection of specific DNA, RNA or protein markers of tumour cells, which are not present in bone marrow and/or peripheral blood cells. High specificity and sensitivity of this specific molecular tumour marker is necessary. Quantitative MRD monitoring by means of molecular methods can determine the decrease or increase of MRD level. In this review, we describe different molecular methods used, an overview on their advantages, limitations, and the sample quality and processing requirements. A summary of molecular markers employed in hematological and non-hematological diseases is also presented. Keywords: minimal residual disease – minimal disseminated disease – circulating tumor cells – PCR – quantitative PCR – Ig/TCR rearrangement
- Klíčová slova
- minimální diseminovaná nemoc, Ig/TCR přestavby,
- MeSH
- buňky kostní dřeně patologie MeSH
- DNA primery MeSH
- DNA genetika MeSH
- genová přestavba T-lymfocytů genetika MeSH
- geny TcR genetika MeSH
- hematologické nádory diagnóza genetika patologie MeSH
- imunofenotypizace MeSH
- krevní buňky patologie MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce metody MeSH
- lidé MeSH
- lymfom diagnóza genetika MeSH
- nádorové biomarkery analýza krev MeSH
- nádorové cirkulující buňky * patologie MeSH
- nádory * diagnóza genetika patologie MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí MeSH
- polymerázová řetězová reakce metody MeSH
- průtoková cytometrie MeSH
- reziduální nádor * diagnóza genetika patologie MeSH
- RNA genetika MeSH
- translokace genetická genetika MeSH
- vyšetřování kostní dřeně metody MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
- Klíčová slova
- systémová autoimunitní onemocnění, micro RNA, epigenetické modifikace,
- MeSH
- autoimunitní nemoci etiologie genetika imunologie MeSH
- epigeneze genetická MeSH
- fosfohydroláza PTEN genetika imunologie MeSH
- geny TcR genetika imunologie MeSH
- imunitní systém - jevy genetika imunologie MeSH
- interferon typ I genetika imunologie MeSH
- lidé MeSH
- RNA interference imunologie MeSH
- TNF-alfa genetika imunologie MeSH
- tyrosinfosfatasa nereceptorového typu 22 genetika imunologie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
