Cíl práce: Zavedení nové molekulární PCR metodiky pro účely typování kmenů Streptococcus pneumoniae v NRL pro streptokokové nákazy. Materiál a metodika: Kmeny Streptococcus pneumoniae jsou zasílány do NRL z různých regionů České republiky. Běžně je identifikace a typizace založena na morfologii kmene, citlivosti k optochinu, rozpustnosti ve žluči, latexaglutinaci a Quellung reakci. Od roku 2012 byla použita nová multiplexová polymerázová řetězová reakce (mPCR). Proběhlo testování nové metody na 210 izolátech S. pneumoniae a na 8 izolátech příbuzných druhů S. pseudopneumoniae, S. sanguinis a S. oralis. Výsledky: Nová mPCR metoda byla v NRL pro streptokokové nákazy aplikována do algoritmu identifikace a především typizace S. pneumoniae. Technika mPCR umožnila správně identifikovat a otypovat všechny kmeny pneumokoků zkoumaného souboru, naopak izoláty příbuzných druhů vykazovaly správnou negativní reakci. Metoda mPCR měla ve zkoumaném souboru 100% senzitivitu i specificitu. Ukázalo se, že PCR reakce je pro typování S. pneumoniae výborně použitelná metoda. Závěr: Sérotypy a séroskupiny S. pneumoniae byly doposud rozlišovány pouze pomocí sérologické Quellung reakce, nyní došlo ke změně a novému zavedení ­mPCR reakce. Jedná se o molekulární metodu zlepšující a zpřesňující typizaci S. pneumoniae.

Study aim: To introduce a novel molecular PCR method for the typing of Streptococcus pneumonia in the National Reference Laboratory (NRL) for Streptococcal Infections. Material and Methods: Strains of Streptococcus pneumoniae are referred to the NRL from different regions of the Czech Republic. Generally, the identification and typing are based on strain morphology, optochin susceptibility, bile solubility, latex agglutination, and the Quellung reaction. Since 2012, a novel multiplex polymerase chain reaction (mPCR) assay has been introduced. The novel assay was tested on 210 S. pneumoniae isolates and 8 isolates of the related species S. pseudopneumoniae, S. sanguinis, and S. oralis. Results: The NRL for Streptococcal Infections has included a novel mPCR assay in the algorithm of S. pneumoniae identification and typing. The mPCR assay was able to identify and type any pneumococcal strain from the study collection, with the isolates of the related species remaining negative. The mPCR assay showed 100% sensitivity and specificity in this study. The pCR appeared to be an excellent tool for S. pneumoniae typing. Conclusion: Until recently, S. pneumoniae serotypes and serogroups were differentiated using a serological approach (Quellung reaction), but the NRL for Streptococcal Infections has switched to a novel mPCR assay. This molecular tool improves S. pneumoniae typing, making it more accurate.

• Klíčová slova
• PCR typování, Quellung reakce,
• MeSH
• algoritmy MeSH
• lidé MeSH
• molekulární typizace MeSH
• multiplexová polymerázová řetězová reakce * metody   statistika a číselné údaje   využití   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• sérotypizace MeSH
• Streptococcus pneumoniae * genetika   klasifikace   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• hodnotící studie MeSH

Streptococcus pneumoniae, patřící celosvětově k velice závažným patogenům, může vyvolat celou škálu různých onemocnění. Na základě strukturální variability polysacharidových pouzderných antigenů se S. pneumoniae klasifikuje do více než 90 sérotypů a 46 séroskupin. Tyto sérotypy a séroskupiny byly doposud rozlišovány především pomocí Quellung reakce. V tomto sdělení prezentujeme nové využití molekulární metody PCR pro identifikaci, ale především typizaci, S. pneumoniae v NRL pro streptokokové nákazy (NRL/STR) Státního zdravotního ústavu Praha. Metodika byla v průběhu roku 2012 v NRL/STR testována a od roku 2013 zařazena do rutinního provozu laboratoře.

Streptococcus pneumoniae is a highly important pathogen worldwide and can cause a range of diseases. Based on the structural variability of capsular polysaccharide antigens, S. pneumoniae is classified into more than 90 serotypes and 46 serogroups. Until recently, serotyping and serogrouping was done by the Quellung reaction. In this article, a novel PCR method for the identification and particularly for the serotyping of S. pneumoniae newly used by the National Reference Laboratory for Streptococcal Infections (NRL/STR) of the National Institute of Public Health, Prague, is presented. Tested in 2012, the method was implemented in routine practice of the NRL/STR in 2013.

• MeSH
• polymerázová řetězová reakce využití   MeSH
• sérotypizace * metody   trendy   MeSH
• Streptococcus pneumoniae * klasifikace   patogenita   MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

Cieľ: Monitoring prítomnosti Streptococcus pneumoniae v nosohltane osôb rôznych vekových skupín v Banskej Bystrici, Slovensko, predovšetkým v detských kolektívoch. Porovnanie výskytu pneumokokov pred a po vakcinácii heptavalentnou konjugovanou vakcínou. Sérotypizácia izolovaných pneumokokov a genetická typizácia pulznou elektroforézou. Metódy: Na detekciu S. pneumoniae vo výteroch z nosohltana bola použitá klasická kultivácia na krvnom agare. Sérotypizácia pneumokokov bola robená pomocou štandardnej Quellungovej reakcie. Detekcia DNA S. pneumoniae bola vykonávaná použitím komerčnej PCR diagnostickej súpravy. Pulzná elektroforéza bola robená modifikovaným postupom podľa viacerých zdrojov. Výsledky: Výskyt pneumokokov klesá a stráca na význame so stúpajúcim vekom. V kolektívoch najmladších detí je relatívne vysoká premorenosť a podobnosť vyskytujúcich sa pneumokokov, čo potvrdzuje ich prenos medzi deťmi navzájom. Po zaočkovaní došlo k zmene v zastúpení jednotlivých sérotypov pneumokoka s výskytom menej nebezpečných sérotypov, aj keď celkový záchyt nebol relevatne nižší. Záver: Monitoring výskytu a typov S. pneumoniae v populácii je dôležitý z hľadiska variability tohto organizmu s ohľadom na možné zmeny v dôsledku očkovania.

Backround: The aim of the present study was to monitor the nasopharyngeal presence of Streptococcus pneumoniae in different age groups ps (especially children) in Banska Bystrica, Slovakia. The purpose of this screening was to determine the prevalence of different serotypes and to follow up the presence of pneumococcus in these children after the vaccination with heptavalent protein-conjugate vaccine. A contribution of molecular biology techniques was the detection of S. pneumoniae DNA by PCR and also the typisation and comparision of pneumococcal strains by pulsed-field gel electrophoresis. Methods: S. pneumoniae in nasopharyngeal swabs was detected by cultivation on blood agar plates. Serotypisation was performed by standard Quellung reaction. The comercial diagnostic kit was used for PCR detection of S. pneumoniae DNA. Pulsed-field electrophoresis was performed by modified scheme according to literature. Results: The incidence of pneumococcus is decreasing and less significant with the increasing age. Among yougest children is relatively high prevalence of pneumococci and the relatedness of isolated strains is high as well. After the vaccination, the less invasive serotypes were detected, although the overal incidence of S. pneumoniae was similar. Conclusions: The monitoring of S. pneumoniae in population is important according to variability of this bacteria with respect to possible changes in pneumococcal types as a consequence of vaccination

• MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   MeSH
• dítě MeSH
• dospělí MeSH
• infekce získané v komunitě mikrobiologie   MeSH
• lidé MeSH
• nazofarynx mikrobiologie   MeSH
• odběr biologického vzorku MeSH
• pneumokokové infekce epidemiologie   prevence a kontrola   MeSH
• pneumokokové vakcíny terapeutické užití   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• předškolní dítě MeSH
• prevalence MeSH
• pulzní gelová elektroforéza metody   MeSH
• senioři MeSH
• séroepidemiologické studie MeSH
• sérotypizace metody   MeSH
• školy MeSH
• Streptococcus pneumoniae izolace a purifikace   patogenita   růst a vývoj   MeSH
• zařízení denní péče pro děti MeSH
• Check Tag
• dítě MeSH
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• předškolní dítě MeSH
• senioři MeSH
• Geografické názvy
• Slovenská republika MeSH

Cíl práce: Za účelem zkvalitnění surveillance invazivního pneumokokového onemocnění (IPO) zavedla Národní referenční laboratoř (NRL) pro streptokokové nákazy metodu celogenomové sekvenace (WGS) Streptococcus pneumoniae. Tato publikace prezentuje první výsledky WGS izolátů S. pneumoniae v České republice. Materiál a metodika: Pro WGS bylo vybráno 35 izolátů S. pneumoniae z IPO z let 2017–2019. Jednalo se o sérotypy 4, 8, 9V, 19A a 22F, které byly určeny pomocí Quellung reakce v kombinaci s metodou end-point multiplexPCR (mPCR). K detailnější charakterizaci, určení sekvenačních typů, se rutinně v NRL používá multilokusová sekvenační typizace (MLST). U vybraných izolátů následovala WGS na platformě Illumina MiSeq. Získané sekvence byly upraveny softwarem Velvet de novo Assembler. Sestavené genomy byly vloženy do PubMLST databáze, využívající platformu BIGSdb, a následně automaticky skenovány a molekulárně charakterizovány. Dále proběhlo vzájemné porovnání izolátů na třech úrovních rozlišení: podle sedmi MLST genů, na podkladě 53 ribozomálních genů (rMLST) a porovnáním 1420 genů (“all loci“). Schéma “all loci“ zahrnuje MLST geny, ribozomální geny a geny core genom MLST (cgMLST). Jedná se o aktuálně všechny definované geny S. pneumoniae v PubMLST databázi. “Distance matrix“, založené na počtu a variabilitě alel všech analyzovaných lokusů, byly vygenerovány automaticky programem Genome Comparator. Fylogenetické sítě byly vytvořeny a editovány v programu SplitsTree4, který využívá algoritmus NeighborNet. Konečná grafická úprava proběhla programem Inkscape. Výsledky: Při celkovém pohledu na fylogenetické sítě lze říci, že genetické linie uvnitř jednotlivých sérotypů (4, 8, 9V, 19A a 22F) jsou u S. pneumoniae vysoce nepříbuzné, a to v míře stejné, jako by se jednalo o izoláty rozdílných sérotypů. Izoláty S. pneumonie stejného sérotypu, ač shodných nebo rozdílných sekvenačních typů, můžeme dle výsledků popsat jako nehomogenní skupinu o určitém počtu nepříbuzných genetických klastrů, které společně sdílí geny, jež jsou zodpovědné za jejich zařazení ke konkrétnímu sérotypu. WGS demonstruje svou detailnost i tím, že umožnila rozdělit izoláty totožného sérotypu i sekvenačního typu do odlišných genetických klastrů. Závěr: Metoda WGS přinesla doposud nejdetailnější charakterizaci izolátů S. pneumoniae z využívaných metod v České republice. Je velice žádoucí její zařazení do molekulární surveillance IPO v České republice, stejně jak probíhá již v některých jiných státech v Evropě i ve světě.

Aim: In order to improve the surveillance of invasive pneumococcal disease (IPD), the National Reference Laboratory (NRL) for Streptococcal Infections implemented whole genome sequencing (WGS) of Streptococcus pneumoniae. This article reports the first WGS data on S. pneumoniae isolates in the Czech Republic. Material and Methods: Thirty-five isolates of S. pneumoniae from IPD recovered in 2017–2019 were selected for WGS. These were serotypes 4, 8, 9V, 19A, and 22F, which were determined by the Quellung reaction in combination with endpoint multiplex PCR (mPCR). Multilocus sequence typing (MLST) is routinely used for more detailed analysis termed sequence typing. The selected isolates were analysed by WGS on the Illumina MiSeq platform. The sequences obtained were processed using the Velvet de novo Assembler software. The assembled genomes were uploaded into the PubMLST database, using the BIGSdb platform, and then scanned automatically and molecularly characterized. The isolates were compared at three resolution levels: seven MLST genes, 53 ribosomal genes (rMLST), and 1420 genes (all loci). The all loci scheme covers MLST genes, ribosomal genes, and core genome MLST genes (cgMLST). These are all currently defined genes of S. pneumoniae available in the PubMLST database. Distance matrices based on the number and variability of all loci analysed were generated automatically using the Genome Comparator tool. Phylogenetic networks were created and edited with the SplitsTree4 package, using the NeighborNet algorithm. The final graphics were edited with the Inkscape software. Results: Based on an overall view of the phylogenetic networks, it can be concluded that the genetic lines within each of S. pneumoniae serotypes 4, 8, 9V, 19A, and 22F are highly unrelated, to the same extent as if the isolates were of different serotypes. S. pneumoniae isolates of the same serotype, whether or not of the same sequence type, can be described, based on the results, as a non-homogeneous group with a number of unrelated genetic clusters that share genes assigning them to a specific serotype. WGS has also shown its discriminatory power, allowing the assignment of isolates of the same serotype and sequence type to different genetic clusters. Conclusion: Of the methods used so far in the Czech Republic, WGS allows the most detailed characterization of S. pneumoniae isolates. It is highly desirable to integrate it in the molecular surveillance of IPD in the Czech Republic, similarly to other countries in Europe and in the world.

• Klíčová slova
• genomová surveillance, sekvenační typ,
• MeSH
• lidé MeSH
• sekvenování celého genomu * MeSH
• sérotypizace MeSH
• Streptococcus pneumoniae * MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH