Characterization of protein-protein and protein-DNA interactions is critical to understand mechanisms governing the biology of cells. Here we describe optimized methods and their mutual combinations for this purpose: bimolecular fluorescence complementation (BiFC), co-immunoprecipitation (Co-IP), yeast two-hybrid systems (Y2H), and chromatin immunoprecipitation (ChIP). These improved protocols detect trimeric complexes in which two proteins of interest interact indirectly via a protein sandwiched between them. They also allow isolation of low-abundance chromatin proteins and confirmation that proteins of interest are associated with specific DNA sequences, for example telomeric tracts. Here we describe these methods and their application to map interactions of several telomere- and telomerase-associated proteins and to purify a sufficient amount of chromatin from Arabidopsis thaliana for further investigations (e.g., next-generation sequencing, hybridization).
- MeSH
- Arabidopsis genetika metabolismus MeSH
- buněčné jádro metabolismus MeSH
- chromatin metabolismus MeSH
- chromatinová imunoprecipitace metody MeSH
- DNA rostlinná metabolismus MeSH
- DNA vazebné proteiny izolace a purifikace metabolismus MeSH
- imunoprecipitace metody MeSH
- mapování interakce mezi proteiny metody MeSH
- optické zobrazování metody MeSH
- proteiny huseníčku genetika metabolismus MeSH
- techniky dvojhybridového systému MeSH
- telomerasa metabolismus MeSH
- telomery metabolismus MeSH
- vazba proteinů MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Rhomboid proteases are intramembrane enzymes that hydrolyze peptide bonds of transmembrane proteins in the lipid bilayer. They play a variety of roles in key biological events and are linked to several disease states. Over the last decade a great deal of structural and functional knowledge has been generated on this fascinating class of proteases. Both structural and kinetic analyses require milligram amounts of protein, which may be challenging for membrane proteins such as rhomboids. Here, we present a detailed protocol for optimization of expression and purification of three rhomboid proteases from Escherichia coli (ecGlpG), Haemophilus influenzae (hiGlpG), and Providencia stuartii (AarA). We discuss the optimization of expression conditions, such as concentration of inducing agent, induction time, and temperature, as well as purification protocol with precise details for each step. The provided protocol yields 1-2.5mg of rhomboid enzyme per liter of bacterial culture and can assist in structural and functional studies of intramembrane proteases.
- MeSH
- DNA vazebné proteiny biosyntéza chemie genetika izolace a purifikace MeSH
- endopeptidasy biosyntéza chemie genetika izolace a purifikace MeSH
- Escherichia coli enzymologie MeSH
- Haemophilus influenzae enzymologie MeSH
- kinetika MeSH
- lipidové dvojvrstvy chemie MeSH
- membránové proteiny biosyntéza chemie genetika izolace a purifikace MeSH
- molekulární biologie metody MeSH
- proteiny z Escherichia coli biosyntéza chemie genetika izolace a purifikace MeSH
- Providencia enzymologie MeSH
- vztahy mezi strukturou a aktivitou MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
Rhomboids are ubiquitous intramembrane serine proteases that are involved in various signaling pathways. This fascinating class of proteases harbors an active site buried within the lipid milieu. High-resolution structures of the Escherichia coli rhomboid GlpG with various inhibitors revealed the catalytic mechanism for rhomboid-mediated proteolysis; however, a quantitative characterization was lacking. Assessing an enzyme's catalytic parameters is important for understanding the details of its proteolytic reaction and regulatory mechanisms. To assay rhomboid protease activity, many challenges exist such as the lipid environment and lack of known substrates. Here, we summarize various enzymatic assays developed over the last decade to study rhomboid protease activity. We present detailed protocols for gel-shift and FRET-based assays, and calculation of KM and Vmax to measure catalytic parameters, using detergent solubilized rhomboids with TatA, the only known substrate for bacterial rhomboids, and the model substrate fluorescently labeled casein.
- MeSH
- buněčná membrána enzymologie MeSH
- DNA vazebné proteiny chemie izolace a purifikace metabolismus MeSH
- endopeptidasy chemie izolace a purifikace metabolismus MeSH
- enzymatické testy metody MeSH
- Escherichia coli enzymologie MeSH
- katalytická doména MeSH
- membránové proteiny chemie izolace a purifikace metabolismus MeSH
- proteiny z Escherichia coli chemie izolace a purifikace metabolismus MeSH
- proteolýza * MeSH
- substrátová specifita MeSH
- vazba proteinů MeSH
- vztahy mezi strukturou a aktivitou MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
Rhabdoidné nádory (RT) sú vzácne, vysoko malígne nádory. Patria do skupiny embryonálnych typov nádorov, a preto sa vyskytujú typicky v útlom detskom veku (medzi 0.–2. rokom života). Najčastejšie sa vyskytujú v mozgu a obličkách, ale môžu vyrastať aj z mäkkých tkanív v ktorejkoľvek časti tela. Rhabdoidné nádory patria medzi veľmi agresívne typy nádorov s vysokou mortalitou. K diagnóze vedie histologické a imunocytochemické vyšetrenie. Tieto nádory môžu byť tvorené výlučne rhabdoidnými bunkami alebo tvoria mix s primitívnymi neuroektodermálnymi, mezenchymálnymi a/alebo epiteliálnymi bunkami, označovanými spoločným názvom – atypický teratoidný/rhabdoidný nádor (AT/RT). Vzhľadom k raritnému výskytu a nie vždy špecifickému histologickému obrazu k diagnostike rhabdoidných nádorov výrazne prispeli molekulárne-genetické štúdie. V patogenéze väčšiny rhabdoidných nádorov hrá zásadnú úlohu bialelická inaktivačná mutácia tumor supresorového génu SMARCB1. Až tretina mutácií je zárodočných, čo viedlo k popisu tzv. rhabdoidného predispozičného nádorového syndrómu. Molekulárno-genetická analýza genu SMARCB1 tak môže byť nápomocná pri stanovení správnej diagnózy, genetickom poradenstve a pri epidemiologických štúdiách.
Rhabdoid tumors (RT) are rare highly malignant tumors. They are part of the embryonic types of tumors and therefore occur in early childhood (between ages of 0–2 years). The most common locations are brain and kidney, but RTs arising usually from soft tissues have been reported widely at most anatomical sites in the body. These tumors are composed of rhabdoid cells alone or as a mixture with primitive neuroectodermal cells, mesenchymal cells and/or epithelial cells, commonly denoted as atypical teratoid/rhabdoid tumours (AT/RT). Based on extremely rare incidence and usually non-specific histological picture, molecular genetic studies are extremely helpful in confirming diagnosis of RT. Biallelic inactivation mutation of the SMARCB1 gene plays a crucial role in the pathogenesis of most RT. One third of mutations are germline mutations leading to the designation of the so-called rhabdoid predisposition syndrome. Molecular genetic analysis of the SMARCB1 gene might be beneficial in the establishment of correct diagnosis, genetic counselling and for epidemiologic studies.
- MeSH
- chirurgie operační MeSH
- chromozomální proteiny, nehistonové genetika izolace a purifikace MeSH
- diagnostické zobrazování metody využití MeSH
- dítě MeSH
- DNA vazebné proteiny genetika izolace a purifikace MeSH
- farmakoterapie MeSH
- financování organizované MeSH
- genetické nemoci vrozené diagnóza genetika MeSH
- genetické testování MeSH
- klinický obraz nemoci MeSH
- kojenec MeSH
- lidé MeSH
- nádory centrálního nervového systému diagnóza genetika terapie MeSH
- nádory ledvin diagnóza genetika terapie MeSH
- rhabdoidní nádor diagnóza genetika MeSH
- teratom diagnóza genetika MeSH
- transkripční faktory genetika izolace a purifikace MeSH
- věkové faktory MeSH
- Check Tag
- dítě MeSH
- kojenec MeSH
- lidé MeSH
Práca podáva prehľadné informácie o novom recesívne dedičnom syndróme, ktorý je charakteristický vývojom malignít v detskom veku. So vznikom tohto syndrómu, nazývaného Syndróm konštitučného deficitu mismeč opravného systému (CMMR-D), sa spájajú bialelické mutácie v génoch, ktoré sú v heterozygotnom stave zodpovedné za vznik Lynchovho syndrómu (Dedičný nádor hrubého čreva bez polypózy – HNPCC). Bialelické zárodočné mutácie génov MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 pri CMMR-D sú charakterizované zvýšeným rizikom hematologických malignít, atypických nádorov mozgu a včasným nástupom nádorov hrubého čreva. Sprievodným prejavom ochorenia je výskyt kožných makúl s difúznymi okrajmi a nerovnomernou pigmentáciou, podobných Café au lait škvrnám u neurofibromatózy 1. Práca predstavuje kazuistiku rodiny s CMMR-D, u ktorej bola objavená homozygotná mutácia MSH6 génu vedúca k vývoju gliomatózy mozgu a T-ALL u 11-ročného dievčatka a glioblastoma multiforme u jej 10-ročného brata. Oba mozgové tumory mali rýchlu progresiu ochorenia. Literárna rešerš mozgových tumorov u detí z CMMR-D rodín poukazuje na rezistenciu týchto mozgových tumorov voči liečbe a skorú smrť u detí. Preto táto práca upozorňuje na dôležitosť skorej identifikácie pacientov s CMMR-D syndrómom. Jednak z hľadiska včasného zahájenia screeningového programu, ako aj skorej chirurgickej intervencie.
This work gives comprehensive information about new recessively inherited syndrome characterized by development of childhood malignancies. Behind this new described syndrome, called Constitutional mismatch repair-deficiency syndrome (CMMR-D), there are biallelic mutations in genes, which cause adult cancer syndrom termed Lynch syndrom (Hereditary nonpolyposis cancer syndrom-HNPCC) if they are heterozygous mutations. Biallelic germline mutations of genes MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 in CMMR-D are characterized by increased risk of hematological malignancies, atypical brain tumors and early onset of colorectal cancers. An accompanying manifestation of the disease are skin spots with diffuse margins and irregular pigmentation reminiscent of Café au lait spots of NF1. This paper reports a case of a family with CMMR-D caused by novel homozygous MSH6 mutations leading to gliomatosis cerebri, T-ALL in an 11-year-old female and glioblastoma multiforme in her 10-year-old brother, both with rapid progression of the diseases. A literature review of brain tumors in CMMR-D families shows that they are treatment-resistant and lead to early death. Therefore, this work highlights the importance of early identification of patients with CMMR-D syndrome – in terms of initiation of a screening program for early detection of malignancies as well as early surgical intervention.
- MeSH
- adaptorové proteiny signální transdukční genetika izolace a purifikace MeSH
- chybné párování bází genetika MeSH
- diagnostické zobrazování metody využití MeSH
- diferenciální diagnóza MeSH
- dítě MeSH
- DNA vazebné proteiny genetika izolace a purifikace MeSH
- genetické testování MeSH
- jaderné proteiny genetika izolace a purifikace MeSH
- lidé MeSH
- lymfom T-buněčný diagnóza komplikace terapie MeSH
- mutace genetika MeSH
- nádory mozku diagnóza genetika terapie MeSH
- neurochirurgické výkony využití MeSH
- oprava DNA genetika MeSH
- rodokmen MeSH
- statistika jako téma MeSH
- věkové faktory MeSH
- Check Tag
- dítě MeSH
- lidé MeSH
- Publikační typ
- kazuistiky MeSH
- MeSH
- Candida genetika metabolismus MeSH
- DNA vazebné proteiny izolace a purifikace metabolismus MeSH
- elektroforéza v polyakrylamidovém gelu MeSH
- mitochondriální DNA chemie izolace a purifikace metabolismus MeSH
- oligodeoxyribonukleotidy chemie metabolismus MeSH
- substrátová specifita MeSH
- telomery MeSH
