Východiska: Akutní lymfoblastická leukémie je nejčastěji diagnostikovanou malignitou dětských pacientů v české republice. V posledních desetiletích byl učiněn nebývalý pokrok v její léčbě, k němuž bezesporu napomohla i řada poznatků týkající se molekulárních charakteristik onemocnění. Analýza expresních profilů pomocí „Arrays“ (čipů) se stala jednou z významných metod při identifikaci potenciálních markerů onemocnění, které by umožnily bližší charakterizaci nádorových buněk a přispěly k porozumění procesu vzniku leukémie i stratifikace léčby. Metody a výsledky:V rámci studie byl sledován vliv methotrexátu na expresi genů p53-signální dráhy u maligních blastů izolovaných z kostní dřeně dětských pacientů s akutní leukémií. Změny exprese genů byly detekovány pomocí „GEArray Q series Human p53 Signalling Pathway Gene Array“. Porovnáním získaných expresních profilů jednotlivých pacientů byly pozorovány odlišné hladiny exprese sledovaných genů u kontrolních buněk, taktéž změny transkripční aktivity vlivem methotrexátu byly různorodé. Kromě jiných došlo vlivem methotrexátu k výrazným změnám transkripce genů uplatňující se při apoptóze či regulaci buněčného cyklu. Změny exprese některých genů byly nalezeny u více pacientů, řada ostatních se však projevila individuálně, nezávisle na typu onemocnění. Závěry: Byly detekovány změny v expresi řady genů p53-signální dráhy u maligních blastů kultivovaných ex vivo s methotrexátem. Odlišné hladiny exprese genů potvrzují značnou heterogenitu dětských leukémií, projevující se v našem souboru v expresních profilech a ve způsobu buněčné odpovědi na přítomnost methotrexátu, jejichž důsledkem může být různá míra citlivosti k aplikované látce a také různá odpověď pacienta na terapii.

Backgrounds: Acute lymphoblastic leukemia is the most frequent malignancy diagnosed in children in the Czech Republic. During last few decades, considerable progress in the treatment had been made and it was similarly contributed by many findings on the molecular basis of the disease. Expression profiling analysis using Macro or Micro Arrays has become an important technique to identify potential markers of the disorder, which might characterise malignant cells and help in the understanding of development of leukaemia and treatment stratification. Methods and Results: In the present study, the effect of methotrexate on the expression of p53-signalling pathway genes was investigated in malignant blasts isolated from the bone marrow of patients with acute leukemia. Expression variations were detected using „GEArray Q series Human p53 Signalling Pathway Gene Array“. Having drawn a comparison between expression profiles, variable gene expression levels in the control cells; likewise various transcription activity alterations were observed. Significant changes in the transcription were found among genes involved in the of apoptosis or cell cycle regulation. Regarding some genes, changes in expression were observed in more that one patient. However, the expression levels of most other genes varied individually, independently on the subtype of the disease. Conclusions: Changes in the expression of p53-signalling pathway genes were detected in the malignant blasts cultivated ex vivo with methotrexate. Different levels of the transcription in our series confirm heterogeneity of childhood leukemias, where patients with the same diagnosis do not need to share identical gene expression profiles even the manner of cellular response on the presence of methotrexate, resulting in the various level of perceptiveness to the medication and in the final response to the therapy.

• MeSH
• DNA, C-Form MeSH
• Gene Expression genetics   drug effects   MeSH
• Financing, Organized MeSH
• Genes, p53 genetics   immunology   drug effects   MeSH
• Hematologic Neoplasms diagnosis   etiology   genetics   MeSH
• Drug Evaluation MeSH
• Bone Marrow MeSH
• Medical Oncology methods   trends   MeSH
• Drug Delivery Systems methods   utilization   MeSH
• Leukemia diagnosis   etiology   genetics   MeSH
• Humans MeSH
• Methotrexate administration & dosage   therapeutic use   MeSH
• Oligonucleotide Array Sequence Analysis methods   utilization   MeSH
• Check Tag
• Humans MeSH

V této publikaci přinášíme přehled vědeckých prací, ve kterých nám technologie cDNA microarrays umožnila nové náhledy do procesů maligní transformace. Díky této technologii dnes můžeme sledovat v jeden okamžik expresní aktivitu tisíců genů. S pomocí vhodných nástrojů můžeme naměřené hodnoty dávat do souvislostí, které byly ještě nedávno prakticky nemyslitelné. V naší laboratoři jsme vyvinuli nové nástroje a postupy pro analýzu microarrays a pro zpracování výsledků do podoby použitelné v onkologickém výzkumu. Pro sledování některých charakteristik je nutné použít vizualizační nástroje. Například pro sledování aktivity určitých oblastí chromosomů jsou velmi vhodné transkripční mapy (dále TM). Implementovali jsme vlastní software pro generování TM a díky kombinaci jeho výstupů s dosavadními znalostmi jsme formulovali závěry našich experimentů. Intuitivním rozšířením TM jsme dosáhli mnoha dalších vizualizací např. hustoty aktivních genů, kumulativní exprese oblastí atp. Tyto nástroje by měly v budoucnosti pomáhat klinikům při diagnostice zhoubných malignit a určování následné léčby.

In this paper we bring a scientific review of studies in which cDNA microarrays technology allowed us to create new insights into malignant transformation processes. We can monitor parallel expression activity of thousands of genes using this technology. Using appropriate tools we can evaluate biological correlations that were practically impossible few years ago. We have developed new tools and techniques transforming the data into form suitable for oncological research. Special visualizations are necessary for some types of studies. E.g. transcription maps (TMs) are a proper tool for studying activity of chromosomal regions. We have implemented our own software for generating TMs. On the basis of combination of its outputs and knowledge gained so far we have formulated our conclusions. Using intuitive TM extensions we have obtained many useful visualizations, e.g. density of active genes, cumulative expression etc. These tools are supposed to help clinicians while forming diagnoses of malignant diseases and while treatment planning.

• MeSH
• Biomedical Research methods   trends   MeSH
• DNA, C-Form diagnostic use   MeSH
• Financing, Organized MeSH
• Medical Oncology methods   trends   MeSH
• Leukemia diagnosis   genetics   immunology   MeSH
• Humans MeSH
• Microchip Analytical Procedures methods   utilization   MeSH
• Colonic Neoplasms diagnosis   genetics   immunology   MeSH
• Gene Expression Profiling methods   utilization   MeSH
• Check Tag
• Humans MeSH
• Publication type
• Review MeSH

Prudký rozvoj čipových technologií v posledních letech umožnil sériové analýzy exprese několika tisíc genů zároveň v jediném experimentu a tím urychlil naše porozumění komplexnosti buněčných procesů. Pomocí mikročipového výzkumu lidského transkriptomu byly odhaleny nové, dříve nerozeznatelné subtypy tumorů, nové diagnostické a prognostické markery nebo potenciální cílové molekuly pro terapii. Aplikace „high-throughput“ technologií v klinické onkologii slibuje do budoucna posun ke každodenním rutinním čipovým analýzám nádorů a na jejich základě individualizaci léčebného programu. Před zavedením mikročipů do klinické praxe je však ještě potřeba vyře- šit nukolik sporných otázek týkajících se analýzy dat, reprodukovatelnosti a validace výsledků, mezilaboratorního srovnávání a v neposlední řadě také problém stále poměrně vysokých pořizovacích i provozních nákladů.

During recent few years, rapid progress in microarray technology has facilitated gene expression analyses of thousands of genes performed simultaneously in one experiment. It has revolutionized our understanding of the cellular processes complexity. Previously subtypes of tumors, new diagnostic and prognostic markers, or potential targets for therapy has been identified by microarray-based research of human transcriptom. In clinical oncology, high-throughput technologies implementation promises their routine application in tumor analyses and individualization of treatment. However, several issues relating to data analysis, reproducibility, cross-comparability, validation, and high purchase and operating costs need to be resolved before the technology can be adopted broadly in the clinical practices.

• MeSH
• DNA, C-Form diagnostic use   MeSH
• Molecular Diagnostic Techniques methods   utilization   MeSH
• Genetic Research MeSH
• Nucleic Acid Hybridization methods   MeSH
• Medical Oncology methods   trends   MeSH
• Humans MeSH
• Microchip Analytical Procedures methods   utilization   MeSH
• Oligonucleotides diagnostic use   MeSH
• Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction methods   utilization   MeSH
• Prognosis MeSH
• Gene Expression Profiling methods   utilization   MeSH
• Dose-Response Relationship, Drug MeSH
• Check Tag
• Humans MeSH
• Publication type
• Review MeSH

V klinické praxi lze využít jako výstup molekulárně genetického testování pouze prokazatelně patogenní - onemocnění způsobující - mutace. Podhodnocení množství celkově zjištěných patogenních mutací nalezených v rámci mutačního screeningu genů BRCA1 a BRCA2 může být způsobeno existencí obtížně interpretovatelných sekvenčních variant. Ze skupiny 25 sledovaných variant neznámého významu nalezených v rámci screeningu u probandů z vysoce rizikových rodin s dědičným výskytem nádoru prsu a/nebo ovaria bylo po následných analýzách určeno šest patogenních splice site mutací a čtyři polymorfní varianty bez vlivu na nádorovou predispozici. Odlišení patogenních mutací od neškodných polymorfních variant má velký praktický význam pro genetické poradenství. Další příčinou podhodnocení záchytu mutace u vysoce rizikových rodin může být přítomnost velkých intragenových přeskupení nedetekovaných screeningovými testy vycházejícími z PCR reakce. Proto byla u 152 nepříbuzných pacientek diagnostikovaných s dědičnou formou nádoru prsu a/nebo ovaria, které byly negativní po kompletním screeningu kódujících sekvencí BRCA1 a BRCA2 genů, provedena MLPA analýza. Bylo identifikováno 6 různých typů rozsáhlých intragenových delecí v BRCA1 genu celkem u 9 vysoce rizikových rodin. Pomocí MLPA se celkové množství nalezených BRCA1 mutací zvýšilo o dalších téměř 8%.

In clinical practice only true pathogenic - disease causing - mutations can be used as an output of molecular genetic testing. Underestimating of total number of pathogenic mutations detected during BRCA1 and BRCA2 genes mutation screening might be due to existence of sequence variants of unknown significance. The group of 25 unknown variants found in probands from high-risk families with hereditary breast and/or ovarian cancer syndrome was examined. After consequent analysis six pathogenic splice site mutations and four polymorphic variants without an effect on cancer predisposition were determined. Differentiating of pathogenic mutations from common benign polymorphisms is very important for genetic counseling. The presence of large intragenic rearrangements commonly overlooked by PCR-based screening techniques is supposed to be another reason for lower prevalence of pathogenic mutations in high-risk families. MLPA analysis was performed in 152 unrelated patients with hereditary breast and/or ovarian cancer syndrome which were negative after complete screening of coding regions of BRCA1/2 genes. Six different large intragenic deletions in BRCA1 gene were identified in nine of high-risk families. Using MLPA the total number of detected BRCA1 mutations were increased about 8%.

• MeSH
• DNA, C-Form genetics   MeSH
• Financing, Organized MeSH
• Genetic Predisposition to Disease genetics   prevention & control   MeSH
• Genetic Techniques utilization   MeSH
• Gene Rearrangement genetics   MeSH
• Genes, BRCA1 MeSH
• Genes, BRCA2 MeSH
• Nested Genes genetics   MeSH
• Medical Oncology methods   trends   MeSH
• Humans MeSH
• Breast Neoplasms etiology   genetics   MeSH
• Ovarian Neoplasms etiology   genetics   MeSH
• Sequence Analysis, DNA methods   utilization   MeSH
• RNA Splicing genetics   MeSH
• Check Tag
• Humans MeSH
• Publication type
• Tables MeSH