Development of competitive quantitative real-time PCR method for detection of C.trachomatis and C.pneumoniae DNAs, Generation of external and internal standards by cloning selected DNA fragments into bacterial plasmids Validation of the method (determination of sensitivity and specificity) and evaluation of diagnostic efficiency, based on testing of the defined panels of clinical samples

Vývoj metody kvantitativního průkazu DNA Chlamydia pneumoniae a Chlamydia trachomatis metodou kompetitivní real-time PCR.1) Navržení primerů a značených sond, optimalizace amplifikačních podmínek. 2)Příprava vnitřního a vnějšího standardu pomocí klonování vybraných úseků DNA do bakteriálních plasmidů.Validace metody (stanovení citlivosti, specifity a robustnosti). Ověření diagnostické účinnosti této metody pomocí testování definovaných souborů pozitivních a negativní vzorků DNA izolované z různých klinických materiálů. Porovnání záchytnosti s jinými dosud používanými metodami přímého průkazu chlamydií. Očekávaným přínosem je zpřesnění a rozšíření možností rychlé diagnostiky chlamydiových infekcí, a tím i ke zlepšení možností jejich úspěšné léčby a epidemiologické prevence.

• MeSH
• Chlamydia trachomatis MeSH
• Chlamydophila pneumoniae MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   trendy   využití   MeSH
• infekční nemoci diagnóza   terapie   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   trendy   využití   MeSH

• Konspekt
• Biochemie. Molekulární biologie. Biofyzika
• NLK Obory
• infekční lékařství
• biologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

Cíl práce: Navržení a validace real-time PCR, vhodné pro kvantitativní průkaz C. pneumoniae a C. trachomatis v klinických vzorcích. Materiál a metody: Jako cílový úsek pro amplifikaci byla zvolena část genu pro 16S RNA. Pomocí klonování produktu reakce v bakteriálním plazmidu byl připraven rekombinantní kalibrátor a kombinovaný interní standard, který lze použít ve třech různých PCR. Pro validaci byly použity archivované izoláty DNA z různých klinických vzorků, izoláty DNA z dalších infekčních agens a kontrolní vzorky pro detekci DNA CT (QCMD) a CPN (Instand). Výsledky: Byla ověřena specificita a reprodukovatelnost reakce. Analytická citlivost byla stanovena na 5–10 kopií bakteriálního genomu/reakci. 105 izolátů DNA z různých typů klinických vzorků (výtěry, moče, periferní krev, BAL) bylo vyšetřeno pomocí real-time PCR a konvenční PCR. Vzorky, které poskytly nesouhlasný výsledek, byly charakterizovány pomocí třetího nezávislého amplifikačního testu. Citlivost a specificita real-time PCR byla 89 % a 100 %. Metoda je vhodná pro screening i diagnostiku chlamydií.

Study objective: Design and validation of a real-time PCR assay for quantitative detection of C. pneumoniae and C. trachomatis in clinical specimens. Material and Methods: A part of the 16S RNA gene was selected as the target sequence for amplification. The reaction product was cloned in the bacterial plasmid and a recombinant calibrator and a combined internal standard were prepared, usable in three different PCR assays. Archived DNA isolates from various clinical specimens, DNA isolates from other infectious agents and control samples for DNA detection, CT (QCMD) and CPN (Instand), were used for validation. Results: Reaction specificity and reproducibility were tested. The analytical sensitivity was set to 5–10 copies of the bacterial genome/reaction. As many as 105 DNA isolates from various types of clinical specimens (swabs, urine, peripheral blood and BAL fluid) were tested by real-time PCR and conventional PCR assays. The specimens that had not yielded concordant results were characterized by a third independent amplification test. The sensitivity and specificity of real-time PCR were 89 % and 100 %, respectively. The assay is suitable for both screening and diagnosis of Chlamydia.

• MeSH
• Chlamydia trachomatis genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• Chlamydophila pneumoniae genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• financování organizované MeSH
• genetické testování metody   využití   MeSH
• lidé MeSH
• mikrobiologické techniky metody   využití   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   využití   MeSH
• sekvenční analýza DNA metody   využití   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• cytomegalovirové infekce diagnóza   etiologie   komplikace   MeSH
• diabetes mellitus 2. typu diagnóza   komplikace   mikrobiologie   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• genetické markery fyziologie   genetika   imunologie   MeSH
• infekce bakteriemi čeledi Chlamydiaceae diagnóza   etiologie   komplikace   MeSH
• interpretace statistických dat MeSH
• kardiovaskulární nemoci diagnóza   komplikace   mikrobiologie   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   využití   MeSH
• sérologické testy metody   využití   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• antigeny MeSH
• chlamydiová pneumonie diagnóza   epidemiologie   MeSH
• chlamydiové infekce diagnóza   imunologie   MeSH
• Chlamydophila pneumoniae patogenita   MeSH
• chronická nemoc MeSH
• infekce dýchací soustavy MeSH
• kardiovaskulární nemoci MeSH
• lidé MeSH
• nemoci imunitního systému MeSH
• protilátky MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• Chlamydia trachomatis izolace a purifikace   patogenita   růst a vývoj   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• mikrobiologické techniky MeSH
• sérologické testy MeSH
• specificita protilátek MeSH