"NI6244" Dotaz Zobrazit nápovědu
Závěrečná zpráva o řešení grantu Interní grantové agentury MZ ČR
Přeruš. str. : tab., grafy ; 32 cm
The study is focused on the clinical and methodological testing of in home PCR technique for diagnostics of lyme borreliosis. It deals with the specifity and sensitivity of PCR and ELISA methods in diagnostics tigether with applicability of the results.
Studie je zaměřena na klinické a metodické testování vlastní PCR metody pro diagnostiku lymeské boréliózy. Sleduje citlivost a specifitu PCR a ELISA metod v diagnostice LB spolu s klinickým spektrem onemocnění.
- MeSH
- lymeská nemoc komplikace diagnóza MeSH
- lymská neuroborelióza diagnóza MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
- sérologické testy MeSH
- Konspekt
- Patologie. Klinická medicína
- NLK Obory
- infekční lékařství
- biologie
- NLK Publikační typ
- závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR
V diagnostice lymeské boreliózy (LB) existuje i v současnosti řada problémů. Naše pracoviště vyvinulo vlastní metodiku přímého průkazu boreliové nukleové kyseliny PCR reakcí, která byla testována v prospektivní studii. Bylo vyšetřováno 32 pacientů s ověřenou diagnózou lymeské neuroboreliózy. Í^NA spirochét byla prokazována v moči a mozkomíšním moku. Moč byla odebírána před léčbou, po léčbě, 3 a 6 měsíců po ukončení hospitalizace, lumbální punkce byla provedena na začátku terapie. PCR reakce probíhala jako dvoustupňová amplifikace(„nesteď' PCR). Byly použity dvě sady primerů: pro chromozomální gen kódující 16S rDNA a pro plazmidový gen kódující protein OspC. Intratékální syntéza protilátek byla stanovována pomocí specifického protilátkového indexu (Alsb). 94 % pacientů mělo prokázanou autochtónni produkci specifických antiboreliových IgG protilátek v mozkoi ^míšním moku. Průkaz DNA spirochét u sledované skupiny v moči byl poměrně vysoký (72 % pozitivních alespoň v jednom vyšetření). Na začátku i na konci léčby byla boreliová nukleová kyselina v moči nalezena u poloviny nemocných, při tříměsíční kontrole byli PCR pozitivní pouze 4 (13 %) a při šestiměsíční již žádný pacient neměl toto vyšetření pozitivní. Z výsledků je zřejmý významný pokles pozitivity PCR během sledování, což může dokládat účinnost antibiotické léčby. Na začátku terapie byla DNA spirochét prokázána v mozkomíšním moku u 44 % pacientů a v moči u 50 %. Tyto výsledky naznačují, že u neuroboreliózy může být moč vhodným materiálem pro diagnostiku i vzhledem k její snadné dostupnosti.
In the diagnosis of Lymeborreliosis (LB) still some problems exist. The authors' department developed their own method of direct evidence of borrelia nucleic acid by the PCR reaction which was tested in a prospective study. 32 patients with a confirmed diagnosis of Lyme neuroborreliosis were examined. Spirochaetale DNA was proved in urine and cerebrospinal fiuid. Urine was collected before and after treatment, 3 and 6 months after termination of hospitalization, lumbar puncture was performed at the onset of therapy. The PCR reaction was implemented as a two-grade amplification („nested" PCR). Two sets of primers were used: For the chromosomal gene coding 16S rDN AN and for the plasmid gene coding protein OspC. Intrathecal synthesis of antibodies was assessed by means of a specific antibody index (Alsb). 94% patients had a confirmed autochthonous production of specific antiborrelia IgG antibodies in the cerebrospinal fluid. Evidence of spirochaetale DNA in the investigated group in urine was relatively high (72% positive in at least one examination). At the onset and at the end of treatment borrelia nuclear acid was found in the urine of half the patients, during the he 3-month check-up only 4 (13%) were PCR positive and during the 6-month check-up no patient was PCR positive. From the results a significant decline of PCR positivity during the investigation is apparent which may be evidence of the effectiveness of antibiotic treatment. At the onset of treatment spirochaetale DNA was detected in the cerebrospinal fluid in 44% patients and in the urine in 50%. These results indicate that in neuroborreliosis urine may be suitable material for the diagnosis, among others, also because it is readily available.
- MeSH
- analýza moči MeSH
- Borrelia burgdorferi patogenita MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- lidé MeSH
- lymská neuroborelióza diagnóza etiologie farmakoterapie MeSH
- nukleové kyseliny krev MeSH
- polymerázová řetězová reakce metody MeSH
- protilátky krev MeSH
- stupeň závažnosti nemoci MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
- srovnávací studie MeSH
U 25 pacientů s diagnózou lymeské neuroboreliózy byla vyšetřena intratékální sekrece specifických antiboreliových protilátek a porovnána s průkazem boreliové DNA v mozkomíšním moku a plazmě. Autochtónni produkce antiboreliových protilátek byla stanovená výpočtem pomocí specifického protilátkového indexu AlBb a na průkazu DNA spirochéty byla použita dvoustupňová polymerázová řetězová reakce („nested" PCR) se třemi sadami primerů: pro plazmidový gen kódující OspC protein a pro chromozomální geny kódující 16S rDNA a flagelin. Specifické antiboreliové protilátky v séru byly detekovány u 20 (80 %) pacientů a intratékální syntéza specifických IgG protilátek byla zjištěna u 22 (88 %) vyšetřovaných. DNA spirochéty byla prokázána v mozkomíšním moku 12krát (48 %) a v plazmě 6krát (24 %). Alespoň Ikrát prokázanou DNA borelii v některém z vyšetřovaných biologických materiá1Ů mělo 13 (52 %) nemocných. U 3 pacientů byla detekována DNA a nebyly u nich nalezeny specifické protilátky. Porovnáním výsledků stanovení autochtónni produkce antiboreliových protilátek a PCR bylo zjištěno, že metoda výpočtu protilátkového indexu byla senzitivnější (88 %) ve srovnání s „přímým" průkazem spirochéty v mozkomíšním moku (48 %) a v plazmě (24 %) před antibiotickou terapií. Získanc výsledky ukázaly, že PCR na průkaz borelií může vhodně doplňovat diagnostiku neuroboreliózy, ale nemůže nahradit „klasickou" sérologii.
In 25 patients with the diagnosis of Lyme neuroborreliosis the intrathecal secretion of specific antiborrelia antibodies was assessed and compared with evidence of Borrelia DNA in cerebrospinal fluid and plasma. Autochthonous production of antiborrelia antibodies was assessed by calculation using the specific antibody index AI Bb and for detection of the DNA of spirochete the authors used the two-stage polymerase chain reaction („nested" PCR) with three sets of primers: for the plasmid gene coding OspC protein and for chromosomal genes coding 16S rDNA and flagellin. Specific antiborrelia antibodies in serum were detected in 20 (80%) patients and intrathecal synthesis of specific IgG antibodies was found in 22/(88%) of the examined subjects. DNA spirochetes were detected in cerebrospinal fluid 12x (48%) and in plasma 6x (24%). At least once DNA of borrelias in some examined biological material was detected in 13 (52%) of the patients. In 3 patients DNA was detected and no specific antibodies were found. By comparison of results of assessment of autochthonous production of antiborrelia antibodies and PCR it was revealed that the method of calculation of the antibody index was more sensitive (88%) as compared with „direct" evidence of the spirochete in cerebrospinal fluid (48%) and in plasma (24%) before antibiotic therapy. The assembled results showed that the PCR for detection of borrelias can usefully supplement the diagnosis of neuroborreliosis but cannot replace „classical" serology.
Cíl práce: Význam polymerázové řetězové reakce v diagnostice lymeské neuroboreliózy a srovnání s průkazem specifických antiboreliových protilátek. Metodika: Na izolaci DNA z moče a mozkomíšního moku byla použita suspenze pryskyřice Chelex 100. DNA z plazmy byla izolována pomocí komerčního setu QlAamp DNA Mini Kit. PCR probíhala jako dvoustupňová amplifikace („nested“ PCR). Byly použity tři sady primerů: pro plazmidový gen kódující OspC protein a pro chromozomální geny kódující 16S rDNA a flagelin. Výsledky: V prospektivní studii bylo vyšetřeno 25 pacientů s diagnózou lymeské neuroboreliózy. DNA spirochéty byla prokázána V mozkomíšním moku u 12 pacientů (48 %), v moči u 13 (52 %) nemocných a v plazmě u 6 (24 %). Specifické antiboreliové protilátky v séru byly detekovány u 20 (80 %) pacientů a autochtonní produkce antiboreliových IgG protilátek v mozkomíšním moku byla zjištěna u 22 vyšetřovaných. Závěr: Na základě získaných výsledků se domníváme, že PCR na průkaz borelií může vhodně doplňovat diagnostiku lymeské neuroboreliózy, ale nemůže nahradit „klasickou“ sérologii.
Aim: The signifikance of polymerase chain reaction in diagnostics of lyme's neuroborreliosis and comparison with the detection of specific anti-borrelia antibodies. Methods: The suspension of resin Chelex 100 was used for the DNA isolation from urine and cerebrospinal fluid. DNA from plasma was isolated by the QlAamp DNA Mini Kit. The nested PCR was used for DNA amplification. All together free sets of primers were used, one set for plasmid gene coding OspC protein, and two other sets for chromosomal genes coding 16S rDNA and flagelin. Results: Twenty-five patiens with the diagnosis of Lyme neuroborreliosis were evaluated in a prospective study. Spirochetal DNA was found in the CSF of 12 patients (48 %), in the urine of 13 pts. (53 %) and in six pts. In blood plasma (24 %). Specific anti-borrelia antibodies were detected in the serum of 20 pts (80 %) and 22 patients showed autochtonous production of antiborrelia IgG antibodies in thein CSF. Conclusion: Our results have shown that PCR detection of borrelia can serve as a useful addendum to diagnostics of lyme neuroborreliosis but cannot replace the „classic“ serology.
Cíl: Ve studii jsme prokazovali specifickou boréliovou nukleovou kyselinu v moči pacientů s nervovými a kloubními formami lymeské boreliózy (LB). Pokusili jsme se zhodnoť přínos této metody v diagnostice LB a vztah výsledků PCR vyšetření k typu klinického postižení a účinku terapie antibiotiky. Metodika: V moči 34 pacientů byla prokazována boréliová DNA pomocí pol^-merázově řetězové reakce. Použili jsme 2 sady primerů: jednu komplementární k úseku chromozomálního genu kódujícího 16S rDNA, druhou komplementární k plazmidovému genu kódujícímu protein OspC. Odběr materiálu byl prováděn na začátku terapie, na konci léčby a 3 měsíce po skončení hospitalizace. Výsledky: Z pacientů vyšetřených na Začátku léčby bylo PCR pozitivních 21 (61 %), na konci léčby byla nalezena PCR pozitivita u 19 (56 %) léčených a 3 měsíce po léčbě u 2 jedinců (8 %). V souboru pacientů s nervovou formou LB bylo 14 nemocných s příznaky meningopolyradikuloneuritidy a 9 nemocných s meningoencefalitidou. Z pacientů s meningopolyradikuloneuritidou vyšetřených na začátku hospitalizace bylo pozitivních 9, na konci hospitalizace byla pozitivita nalezena u 4 jedinců. Při kontrolním vyšetření 3 měsíce po léčbě nebyla boréliová DNA nalezena ani u jednoho pacienta. Ze skupiny pacientů s meningoencefaliudou byli na začátku terapie 4 pacienti PCR pozitivní. Na konci terapie bylo 8 PCR pozitivních ze všech nemocných s příznaky meningoencefalitidy a po 3 měsících byla nalezena boréliová nukleová kyselina u 1 vyšetřeného. Ze 6 pacientů s kloubní formou LB byla polovina PCR pozitivních na začátku hospitalizace, na konci byla boréliová nukleová kyselina stanovena u 5 vyšetřovaných a při kontrolním vyšetření nebyla nalezena ani u jednoho pacienta. U akutních forem LB bylo vyšší procento (77 %) pozitivních jedinců oproti pacientům s chronickými příznaky (57 %). Závěr: Práce potvrdila, že moč je vhodným materiálem pro diagnostické účely u LB. Naše metoda PCR poskytuje ve významné míře pozitivní výsledky u pacientů s LB prokázanou na základě „klasických metod“. Tato metoda má dostatečnou senzitivitu, která však neumožňuje použít ji při určování diagnózy solitárně. Proto je třeba použít všechny diagnostické možnosti paralelně, aby efektivita při stanovování diagnózy byla maximální.
- MeSH
- dítě MeSH
- DNA bakterií moč MeSH
- dospělí MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- lymská neuroborelióza diagnóza mikrobiologie moč MeSH
- meningoencefalitida mikrobiologie MeSH
- mladiství MeSH
- neuritida mikrobiologie MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
- protilátky bakteriální krev MeSH
- radikulopatie mikrobiologie MeSH
- senioři MeSH
- Check Tag
- dítě MeSH
- dospělí MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mladiství MeSH
- senioři MeSH
Práce: Stanovení antiboreliových protilátek v mozkomíšním moku s využitím dvou odlišných antigenů B. garinii a B. afzelii. Metodika: Na průkaz specifických antiboreliových protilátek byly použity české komerční soupravy EIA Borrelia afélii IgM/IgG a EIA Borrelia garinii IgM/IgG. Pracovní postup byl dodržen přesně podle instrukcí výrobce. Výsledky: Bylo vyšetřeno 45 mozkomíšních moků od pacientů s diagnózou lymeské neuroboréliózy a 42 „kontrolních“ mozkomíšních moků od pacientů s virovými meningoencefalitidami. Oběma soupravami byly nalezeny shodné výsledky u 74 (85 %) a rozdílné u 13 (15 %) pacientů. Z těchto 13 odlišných stanovení byly v 7 případech nalezeny malé odchylky tj. hraniční výsledky proti negačním nebo hraniční výsledky proti pozitivním. U 6 pacientů byl průkaz protilátek ve třídě IgG rozdílný. 5x byly detekovány v mozkomíšním moku protilátky pouze proti B. afzelii a 1x jenom proti B. garinii. Antiboreliové protilátky v mocích u kontrolní skupiny nebyly prokázány. Závěr: Z naměřených výsledků usuzujeme, že nedochází k podstatným rozdílům ve stanovení antiboreliových protilátek v mozkomíšním moku použitými soupravami. Nebyly prokázány ani žádné falešně pozitivní nálezy. Souprava EIA Borrelia afzelii však vykazovala v obou třídách vyšší senzitivitu (91 %/lgM, 95 %/IgG) v porovnání se soupravou EIA Borrelia garinii (64 %/IgM, 65 %/IgG). Specificita obou testů byla srovnatelná.
- MeSH
- antigeny bakteriální diagnostické užití MeSH
- Borrelia imunologie MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- lidé MeSH
- lymská neuroborelióza MeSH
- protilátky bakteriální MeSH
- reagenční diagnostické soupravy normy MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- srovnávací studie MeSH
U 16 pacientů s diagnózou lymeské neuroboreliózy byla zjišťována možnost průkazu specifických boreliových antigénu v mozkomíšním moku. Byla použita metoda polyakrylamidové elektroforézy S následným Western blottingem a detekcí antigénu pomocí myších monoklonálních protilátek izotypu IgG reagujících s flagelámím proteinem a vnějším membránovým proteinem OspB. Průkaz antigénu byl porovnán s přítomností volných specifických antiboreliových protilátek, popřípadě s protilátkami vyvázanými v cirkulujících imunitních komplexech a s průkazem DNA borelií v mozkomíšním moku pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Vyšetřovaný soubor byl rozdělen na dvě skupiny. Z první skupiny 8 pacientů s autochtónni produkcí specifických protilátek v mozkomíšním moku byly oba boreliové antigény, fiagelámí protein i OspB prokázány u 2 nemocných s negativním průkazem DNA. Ve druhé skupině 8 pacientů, u kterých specifické protilátky nebyly nalezeny, se podařilo boreliové antigény prokázat u 4 (fiagelámí protein Ikrát, OspB 2krát a oba antigény Ikrát), z toho 3 pacienti měli pozitivní i PCR V moku. Celkově byly boreliové antigény zjištěny u 6 pacientů z 16 vyšetřovaných, přičemž častěji (4krát) byly zachyceny v mocích, ve kterých nebyly nalezeny specifické protilátky. Z hlediska nervového postižení se jednalo 4krát o meningoencefalitidu, Ikrát o meningoradikulitídu a Ikrát o polyneuritidu.
In 16 patients with the diagnosis of Lyme borreliosis the authors assessed the possibility of detection of specific borrelia antigens in cerebrospinal fluid. They used the method of polyacrylamide electrophoresis with subsequent Western blotting and detection of antigens using mouse monoclonal antibodies isotype IgG reacting with flagellar protein and external membrane protein OspB. Antigen detection was compared with the presence of free specific antiborrelia antibodies or antibodies obtained from circulating immune complexes and with evidence of DNA of borrelias in cerebrospinal fluid by means of the polymerase chain reaction (PCR). The examined group was divided into two sub-groups. In the first group of 8 patients with autochthonous production of specific antibodies in cerebrospinal fluid both borrelia antigens, flagellar protein and OspB were detected in two patients with negative evidence of DNA. In the second group of 8 patients where specific antibodies were not detected it proved possible to detect borrelia antigens in 4 (flagellar protein Ix, OspB 2x and both antigens Ix) mcl. 3 patients who had also a positive PCR in cerebrospinal fluid. Altogether borrelia antigens were found m 6 patients of 16 examined, whereby antigens were detected more frequently in liquors (4x) where there were no 1x meningoradiculitis and 1x polyneuritis.
Cíl práce: Sestavení a ověření postupu PCR na průkaz Borrelia burgdorferi v moči pacientů s lymeskou boréliózou (LB). Metodika: Na izolaci DNA z moče byla použita suspenze pryskyřice Chelex 100. PCR probíhala jako dvoustupňová amplifikace („nested" PCR). Byly použity dvě sady primerů : pro plazmidový gen kódující Osp C protein a pro chromozomální gen kódující 16S rDNA. Možná přítomnost inhibitorů způsobující falešně negativní výsledky byla kontrolována přidáním lidské DNA do reakční směsi a koamplifikací s lidskými genomickými primery. Výsledky: Z 28 vyšetřovaných pacientů byla DNA prokázána u 20 (11 x u neuroboréliózy, 3 x u lymeské arthritidy, 6 x u pacientů suspektních z LB). Nejvíce pozitivních výsledků bylo dosaženo pro OspC systém (17/20, 85 %), dále pro 16S rDNA systém (7/20, 35 %). Amplifikace s oběma sadami primerů se podařila pouze u 4 pacientů (4/20, 20 %)Závěr: Touto prací jsme ověřili možnost průkazu DNA Borrelia burgdorferi v moči. Současně se nám potvrdil poznatek pozorovaný i jinými autory, že při DNA diagnostice spirochéty je nutno paralelně užít nejméně dva PCR systémy.
Objective: Elaboration and verification of a PCR procedure for the detection of Borrelia burgdorferi in the urine of patients with Lyme borreliosis (LB). Methods: A suspension of the resin Chelex 100 was used for the isolation of DNA from urine. The PCR was designed as a two-step amplification („nested" PCR). Two sets of primers were used: one for the plasmid gene coding Osp C protein, and the other for chromosonal gene coding 16,168 n rDNNA. A possible presence of inhibitors causing false negative results was controlled by adding human DNA to the reaction and by co-amplification with human genome primers. Results: Of the 28 patients examined DNA was detected in 20 of them: 1 Ix in neuroborreliosis, 3x in Lyme arthritis, 6x in patients suspected of LB. Most of the positive results were obtained with the Osp C System (17/20, 85 %), followed by the 16S rDNA system (7/20, 35 %). Amplification with both sets of primers was successful in 4 patients only (4/20, 20 %). Conclclusion: The feasibility of detecting DNA of B. burgdorferi in urine was verified. Further, it was confirmed, that in the DNA diagnostics of spircpchetes at least two PCR systems must be used concurrently, a finding observed by other authors as well.
