Cílem předkládaného projektu je zavedení metody FISH využívající antisense oligonukleotidové sondy pro diagnostiku expandovaných repetitivních sekvencí CTG a CCTG v genu DMPK resp. ZNF9 spojených s diagnosou DM1 resp. DM2. Typem mutace odpovědné za DM1 aDM2 je expanze krátkých repetitivních sekvencí a jedním z dalších diagnostických kroků je určení počtu těchto repetic metodou PCR (u alel s menším počtem repetic) a Southernovy hybridizace. Dalším úkolem projektu je klinické, elektromyografické a kardiologické sledování pacientů s diagnózou DM1 a DM2 a závěrečné vyhodnocení korelace mezi fenotypovými projevy a detekovanými změnami na molekulární a buněčné úrovni.; The proposed project aims to introduce FISH using fluorescently labeled oligonucleotide probes for detection the expanded repetitive sequences CTG and CCTG in the DMPK gene and ZNF9 gene resp. which are connected with DM1 and DM2. The mutations resposible for DM1 and DM2 are the short repetitive sequences and one from the next steps in diagnostics is the assessment of the number of the repeats by PCR (in shorter alleles) and Souther hybridization. The next task of the project is clinical, electrophysiological and cardiological testing of the DM1 and DM2 patients and the final evaluation of the correlation between the phenotypic features and the detected mutations.

• MeSH
• diabetes mellitus 1. typu komplikace   MeSH
• diabetes mellitus 2. typu komplikace   MeSH
• diferenciální diagnóza MeSH
• expanze trinukleotidových repetic MeSH
• hybridizace in situ fluorescenční metody   MeSH
• myotonická dystrofie diagnóza   MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• neurologie
• biologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

Myotonické dystrofie (DM 1 a DM 2) jsou multisystémová onemocnění s autozomálně dominantní dědičností projevující se především svalovou slabostí, myotonií, kataraktou, srdečními převodními poruchami a kardiomyopatií. V literatuře jsou uváděny různé změny na obrazech magnetické rezonance (MRI) mozku u pacientů s myotonickou dystrofií. V souboru 13 pacientů s DM 1 autoři prokázali gliové změny v periventrikulární a hluboké bílé hmotě parietálních, okcipitálních a frontálních laloků (se sestupnou četností) celkem u 11 pacientů (84 %). U 8 pacientů (62 %) se navíc zobrazily i gliové změny v subkortikální bílé hmotě předních částí temporálních laloků. U 8 pacientů (62 %) byla popsána atrofie mozku. U 9 pacientů (69 %) byla nápadnější šíře Virchowových-Robinových perivaskulárních prostorů. U 3 pacientů (23 %) bylo prokázáno rozšíření kalvy; 2 pacienti (15%) měli zcela normální nález v MRI obraze. Studie prokazuje, že v MRI obrazech hlavy a mozku pacientů s myotonickou dystrofií DM 1 se s různou četností vyskytují strukturální a signálové změny především v bílé hmotě, které jsou samy o sobě nespecifické. Jejich kumulace v charakteristických lokalitách podporuje klinickou diagnózu myotonické dystrofie. Negativní nález v MRI obraze mozku onemocnění nevylučuje.

Myotonic dystrophies (DM 1 and DM 2) are multisystem disorders with autosomal dominant heredity manifested particularly with muscular weakness, myotonia, cataract, cardiac transmission disturbances and cardiomyopathy. In literature there are given various changes in pictures of magnetic resonance (MRI) of the brain in patients with myotonic dystrophy. A set of 13 patients with DM 1 demonstrated glial changes in the perivascular and deep white matter of the parietal, occipital and frontal lobes (with increasing frequency) in the total of 11 subjects (84%), moreover, even glial changes in the subcortical white matter of the frontal parts of temporal lobes were seen in 8 patients (62%), the cerebral atrophy was described in 8 subjects (62%). Nine patients (69%) showed striking width of Virchow-Robin´s perivascular spaces. The cranium was dilated in 3 patients (23%). Two patients (15%) had a quite normal finding in the MRI picture. The study has demonstrated that MRI of the head and brain in patients with myotonic dystrophy DM 1 shows various frequency of structural and signal changes occurring particularly in the white matter and they are in themselves non-specific. Their cumulation in characteristic locations has confirmed clinical diagnosis of myotonic dystrophy. A negative finding in the brain MRI does not eliminate the disease.

• MeSH
• financování organizované MeSH
• lidé MeSH
• magnetická rezonanční tomografie MeSH
• myotonická dystrofie klasifikace   patologie   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Histopatologické rysy obou v současnosti definovaných forem myotonické dystrofie (MD1 i MD2) jsou velmi podobné, vykazují charakteristický komplex změn. Vyšetření svalových biopsií in situ může kromě toho přinést i zjištění přítomnosti expanzí repetic CUG resp. CCUG v transkriptu mutované DNA, která tvoří genetický základ onemocnění. Expandované úseky lze znázornit ve tkáňových řezech metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) jako fokální intranukleární inkluze. Pro posouzení významu svalové biopsie v době, kdy je diagnostika MD1 a MD2 založena na DNA analýze lymfocytů z periferní krve, jsme analyzovali výsledky histopatologického vyšetření souboru 34 nemocných, u kterých byla biopsie provedena na základě klinického podezření na myotonickou dystrofii. Diagnóza MD byla potvrzena analýzou DNA pro oba typy onemocnění. FISH byla provedena u 27 z nich. Mutační analýzou DNA byla potvrzena MD1 v 13 případech, MD2 v 10 případech, u 11 pacientů nebyla diagnóza MD1 či MD2 potvrzena. Ve většině případů byl bioptický histopatologický nález u prokázané MD hodnocen buď jako typický pro MD1 či MD2, anebo nález kompatibilní s touto diagnózou. Bioptické nálezy u některých pacientů s MD byly atypické: ve 2 případech byla přítomna zánětlivá infiltrace, v jednom případě obraz připomínající kongenitální myopatii. Naproti tomu histopatologické rysy MD byly zjištěny v některých biopsiích, u nichž diagnóza MD1 ani MD2 nebyla potvrzena. Fokální intranukleární inkluze prokazované FISH byly prokázány u 23 pacientů – ve shodě s výsledky analýzy DNA – u 13 s MD1 a u 10 s MD2. Metodou volby při podezření na myotonickou dystrofii je mutační analýza DNA z periferní krve. V případě provedené svalové biopsie z důvodu atypického klinického obrazu, který nevedl k podezření na MD, však může zhodnocení biopsie vést k dodatečnému molekulárně-genetickému vyšetření pacienta. Metoda FISH v biopsii je zajímavá z teoretického pohledu, neboť umožňuje zkoumat retinovanou RNA v jádrech jednotlivých buněk a tkání postižených pacientů, a tak může napovědět o jejich možné účasti v patogenezi onemocnění.

The histopatological features of both so far defined types of myotonic dystrophy (DM1 and DM2) are very similar, the affected muscles show a typical pattern of changes. The examination of muscle biopsies in situ may also bring about revealing of expansions of CUG or CCUG repetitons in transcripts of the mutated DNA, the genetic basis of the diseases, which may be demonstreated by FISH (fluorescence in situ hybridization) as intranuclear focal accumulation of the transcript. In order to evaluate the importance of muscle biopsy including FISH at the time, when the diagnosis of DM is based on DNA analysis from blood lymphocytes, we analysed the results of histopathological examination of 34 patients, where the biopsy was indicated by clinical suspicion of myotonic dystrophy. The diagnosis was verified by mutation analysis of DNA for both DM1 and DM2. The examination was supplemented by FISH in 27 patients. The diagnosis of DM1 was confirmed in 13 patients, DM2 in 10 patients, the diagnosis of DM1 or DM2 was not confirmed in 11 patients. The biopsy brought about confirmation or precision-specification of the clinical diagnosis or suggested the diagnosis of DM in the majority of the patients. The bioptic findings in some patients with DM were atypical: in two cases there was inflammatory infiltration, in one case a picture resembling congenital myopathy. On the other hand, histopathological features of myotonic dystrophy were present in several biopsies where the diagnosis of DM was not confirmed. Focal accumulation of CUG/CCUG repeats in myonuclei was demonstrated by fluorescence in situ hybridization – in accordance with the DNA examination – in 23 patients, 13 with DM1 and 10 with DM2. Mutation analysis of the DNA isolated from blood leukocytes represent the method of choice if the diagnosis of DM is suspected. On the other hand, muscle biopsy may reveal histopathological features that may indicate subsequent molecular genetic examination of the patient if the results of the clinical examination are equivocal or atypical. FISH in the biopsy may reveal the intranuclear focal accumulation of the RNA transcripts in cells and tissues of the affected patiens and, in this way, to suggest a possible participation of them in the pathogenesis of the disease.

• MeSH
• biopsie metody   využití   MeSH
• cytogenetické vyšetření využití   MeSH
• financování organizované MeSH
• histologie srovnávací metody   MeSH
• hybridizace in situ fluorescenční metody   využití   MeSH
• interpretace statistických dat MeSH
• lidé MeSH
• mutace genetika   MeSH
• myotonická dystrofie diagnóza   genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Human neurodegenerative and neuromuscular disorders are associated with a class of gene mutations represented by expansion of trinucleotide repeats. DNA testing is important for the diagnosis of these diseases because clinical discrimination is complicated by their late onset and frequently overlapping symptomatology. However, detection of pathologic alleles expanded up to several thousand trinucleotides poses a challenge for the introduction of rapid, fully automatic, and simple DNA diagnostic procedures. Here we propose a simple two-step polymerase chain reaction (PCR) protocol for rapid molecular diagnostics of myotonic dystrophy, Huntington's disease, and possibly also other triplet expansion diseases. Standard PCR amplification with target repeat flanking primers is used for the detection of alleles of up to 100 repeats; next, triplet-primed PCR is applied for detection of larger expansions. Automated capillary electrophoresis of amplicons allows rapid discrimination between normal, premutated and expanded (CTG/CAG)(n) alleles. Using the suggested protocol, the expanded allele was successfully detected in all test DNA samples with known genotypes. Our experience demonstrates that the suggested two-step PCR protocol provides high sensitivity, specificity, and reproducibility; is significantly less time-consuming; is easier to perform; and provides a better basis for automation than previous methods requiring Southern analysis. Therefore, it can be used for confirmation of uncertain clinical diagnoses, for prenatal testing in at-risk families, and, generally in research on these diseases.

• MeSH
• alely MeSH
• automatizované zpracování dat MeSH
• detekce genetických nosičů metody   MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   MeSH
• expanze trinukleotidových repetic MeSH
• financování organizované MeSH
• Huntingtonova nemoc genetika   MeSH
• jaderné proteiny genetika   MeSH
• lidé MeSH
• molekulární sondy - techniky MeSH
• myotonická dystrofie genetika   MeSH
• nestabilita genomu MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• proteiny nervové tkáně genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• validační studie MeSH

Myotonická dystrofie 2. typu je způsobena expanzí čtveřice nukleotidů v genu ZNF9 ("zinc-finger protein 9") na 3. chromozomu. Ve srovnání s myotonickou dystrofií 1. typu (19ql3.3) se jedná o variantu, která se vyskytuje převážně v Evropě a je považována za méně častou. Oba typy sdílí řadu společných klinických znaků, ale i některé odlišnosti ve frekvenci klinických projevů. Byla vyšetřena skupina nemocných s klinickým a elektrofyziologickým obrazem myotonické myopatie, u kterých nebyla nalezena mutace odpovídající myotonické dystrofii 1. typu. Při DNA diagnostice byly použity metody PCR a „Triplet-Primed" PCR. Autoři nalezli 18 pozitivních mutací. Potíže probandů se manifestovaly od 20 do 50 let věku, v průměru v 33 letech. V 16 případech byla přítomna kořenová slabost dolních končetin, jeden nemocný měl naopak slabost spíše pletence ramenního. Ze systémových projevů byla v 9 případech přitomna katarakta, 2x skolióza, 2x leukoencefalopatie. Postižení převodního systému bylo nalezeno 3x, svalové bolesti udávalo 8 osoh.

Myotonic dystrophy of the 2nd type is caused by expansion of four nucleotides in gene ZNF9 („zinc-finger protein 9") on the 3rd chromosome. If compared with myotonic dystrophy of the 1st type (19ql3.3), it is a variant occurring mainly in Europe and considered to be of lesser frequency. Both types have a number of common clinical features, but also some dissimilarities in the frequency of clinical manifestations. An examination was carried out in a set of patients with clinical and electrophysiological pictures of myotonic myopathy in whom no mutation corresponding with myotonic dystrophy of the 1st type was found out. In the DNA diagnostics, methods of PCR and „TripletPrimed" PCR were appHed. 18 positive mutations were revealed. The probands' complaints were manifested between 20 and 50 years of age, on the average, at 33 years. 16 cases presented proximal weakness of the lower extremities, on contrary, one patient showed the shoulder girdle weakness. Out of systemic problems, cataract was present in 9 cases. scoliosis in 2 patients, leukoencephalopathy in 2 subjects. The involvement of a conductive system was found 3x, muscular pains were reported by 8 subjects.

• MeSH
• diagnostické techniky molekulární MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• lidé MeSH
• myotonická dystrofie epidemiologie   genetika   klasifikace   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH