Niemann-Pick type C disease (NPC) can present in any age and especially in adulthood it may be misdiagnosed or detected late. The novel diagnostic test for NPC is based on loading of cells with cholesterol-dextran nanoparticles (Chol/Dex) in order to amplify the differences in metabolite levels between NPC controls and patients. Deuterium-labeled cholesterol in Chol/Dex will enable quantification of endocytosed cholesterol by tandem-mass spectrometry. Optimized test will be evaluated in more than 25 skin fibroblast cell lines from patients with different forms of NPC; cholesterol/cholesteryl ester ratio will be calculated. Cell lines homozygous for frequent variants in NPC1 gene implicated in adult forms of NPC will be created by genome editing using CRISPR-Cas9 and evaluated using the Chol/Dex-based test to determine their pathogenicity. The test will be adapted to white blood cells and cultured lymphocytes and its usefulness for diagnostics of NPC will be evaluated.

Niemann-Pickova choroba typu C (NPC) se může projevit poprvé v jakémkoli věku a zejména v dospělosti může být diagnostikována pozdě nebo chybně. Nový kvantitativní diagnostický test pro NPC, který podstatně usnadní diagnostiku nemoci, je založen na zátěži buněk cholesterol-dextranovými nanočásticemi (Chol/Dex) pro zvýraznění rozdílů v koncentracích metabolitů mezi pacienty s NPC a kontrolami. Deuterovaný cholesterol v Chol/Dex dovolí kvantifikaci endocytovaného cholesterolu tandemovou hmotnostní spektrometrií. Optimalizovaný test bude proveden ve více než 25 kulturách kožních fibroblastů pacientů s různými formami NPC a bude vypočítán poměr cholesterol/cholesteryl ester. Technikou CRISPR-Cas9 připravíme buněčné linie homozygotní pro časté varianty v genu NPC1 spojované s dospělou formou nemoci a pomocí testu určíme jejich patogenitu. Test bude upraven pro užití v bílých krvinkách a kultivovaných lymfocytech a bude zhodnoceno jeho možné diagnostické využití.

• MeSH
• alely MeSH
• cholesterol MeSH
• dextrany MeSH
• hmotnostní spektrometrie metody   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci s pozdním začátkem diagnóza   MeSH
• Niemannova-Pickova nemoc typu C diagnóza   MeSH
• protein Cas9 MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• neurologie
• genetika, lékařská genetika
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

Cílem sdělení je shrnutí současného přístupu k diagnostice Niemann-Pickovy choroby typu C (NP-C) s důrazem na nové laboratorní techniky. NP-C je závažné autozomálně recesivní neuroviscerální onemocnění a aktuální dostupnost terapie ovlivňující průběh nemoci zvyšuje důležitost její včasné diagnostiky. Dědičně podmíněný deficit transportního proteinu pro cholesterol (NPC1 nebo NPC2) u NP-C vede k poruše transportu lipidů uvnitř buňky. Ověření klinického podezření na NP-C se proto opírá o biochemické a/nebo molekulárně genetické metody. Nové metody využívajících analýzu biomarkerů v krevním séru nebo plazmě a pokročilé sekvenační techniky mají nyní v diagnostice NP-C důležitou roli. U části pacientů je pro ověření diagnózy nutné použít více vzájemně se doplňujících vyšetření, vč. v článku diskutovaných pokročilých buněčných a biochemických technik. Ty proto musí být k disposici ve specializované laboratoři.

This review provides a summary of current approaches to Niemann-Pick disease type C (NP-C) dianostics with an emphasis on novel laboratory techniques. NP-C is a severe autosomal recessive neurovisceral disorder and the recent availability of disease-modifying therapies increases the importance of its timely diagnosis. The hereditary deficiency of cholesterol transporter proteins (NPC1 or NPC2) in NP-C leads to abnormal intracellular lipid trafficking. Clinical suspicion for NP-C has to be confirmed by biochemical and/or molecular genetic methods. Novel biomarkers in serum or plasma and advanced sequencing techniques now have a prominent role in NP-C diagnostics. In a subset of patients, it is necessary to use several complementary techniques for confirmation of NP-C diagnosis, including advanced biochemical and cellular assays discussed in the paper. These methods therefore have to be available in a specialized laboratory.

• Klíčová slova
• filipinový test, lyzosfingolipidy, intracelulární transport cholesterolu,
• MeSH
• biologické markery MeSH
• lidé MeSH
• Niemannova-Pickova nemoc typu C * diagnóza   MeSH
• oxysteroly MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

BACKGROUND: Niemann-Pick type C (NP-C) is a rare neurovisceral genetic disorder caused by mutations in the NPC1 or the NPC2 gene. NPC1 is a multipass-transmembrane protein essential for egress of cholesterol from late endosomes/lysosomes. To evaluate impacts of NPC1 mutations, we examined fibroblast cultures from 26 NP-C1 patients with clinical phenotypes ranging from infantile to adult neurologic onset forms. The cells were tested with multiple assays including NPC1 mRNA expression levels and allele expression ratios, assessment of NPC1 promoter haplotypes, NPC1 protein levels, cellular cholesterol staining, localization of the mutant NPC1 proteins to lysosomes, and cholesterol/cholesteryl ester ratios. These results were correlated with phenotypes of the individual patients. RESULTS: Overall we identified 5 variant promoter haplotypes. Three of them showed reporter activity decreased down to 70% of the control sequence. None of the haplotypes were consistently associated with more severe clinical presentation of NP-C. Levels of transcripts carrying null NPC1 alleles were profoundly lower than levels of the missense variants. Low levels of the mutant NPC1 protein were identified in most samples. The protein localised to lysosomes in cultures expressing medium to normal NPC1 levels. Fibroblasts from patients with severe infantile phenotypes had higher cholesterol levels and higher cholesterol/cholesteryl ester ratios. On the contrary, cell lines from patients with juvenile and adolescent/adult phenotypes showed values comparable to controls. CONCLUSION: No single assay fully correlated with the disease severity. However, low residual levels of NPC1 protein and high cholesterol/cholesteryl ester ratios associated with severe disease. The results suggest not only low NPC1 expression due to non-sense mediated decay or low mutant protein stability, but also dysfunction of the stable mutant NPC1 as contributors to the intracellular lipid transport defect.

• MeSH
• fibroblasty metabolismus   MeSH
• intracelulární signální peptidy a proteiny MeSH
• lidé MeSH
• membránové glykoproteiny * genetika   metabolismus   MeSH
• mladiství MeSH
• mutace genetika   MeSH
• transportní proteiny * genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mladiství MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Acid sphingomyelinase deficiency (ASMd, Niemann-Pick disease A/B) and Niemann-Pick type C disease (NPC) share core clinical symptoms. Initial diagnostic discrimination of these two rare lysosomal storage diseases is thus difficult. As sphingomyelin accumulates in ASMd as well as NPC, lysosphingomyelin (sphingosylphosphorylcholine) and its m/z 509 analog were suggested as biomarkers for both diseases. Herein we present results of simultaneous LC-ESI-MS/MS measurements of lysosphingomyelin and lysosphingomyelin 509 in plasma and dried blood spots (DBS) collected from ASMd and NPC patients and suggest that the plasma but not DBS levels of the two analytes allow differential biochemical screening of ASMd and NPC.

• MeSH
• biologické markery krev   MeSH
• chromatografie kapalinová metody   MeSH
• fosforylcholin analogy a deriváty   krev   MeSH
• hmotnostní spektrometrie s elektrosprejovou ionizací metody   MeSH
• lidé MeSH
• Niemannova-Pickova nemoc typu A krev   diagnóza   MeSH
• Niemannova-Pickova nemoc typu B krev   diagnóza   MeSH
• Niemannova-Pickova nemoc typu C krev   diagnóza   MeSH
• sfingosin analogy a deriváty   krev   MeSH
• studie případů a kontrol MeSH
• tandemová hmotnostní spektrometrie metody   MeSH
• test suché kapky krve metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• srovnávací studie MeSH