Metylace cytozinů v DNA je jedním z epigenetických mechanizmů regulujících expresi genů, a hraje tak důležitou roli v diferenciaci nebo proliferaci buněk. V nádorových buňkách často dochází ke změnám v metylaci DNA, kupříkladu nadměrnou metylací (hypermetylací) promotorů tumor supresorových genů. Proto jsou vyvíjeny nové metody analýzy, které by byly schopny určit rozsah metylace konkrétní sekvence DNA. K těmto metodám se řadí i relativně levné a rychlé techniky MS-HRM (methylation-specific high resolution melting) a elektrochemie. Ve srovnání s jinými používanými metodami jsou vhodné pro screening většího počtu vzorků či více cílových oblastí DNA. MS-HRM svou citlivostí a relativní nenáročností konkuruje ostatním zavedeným metodám, jako jsou metylačně-specifická PCR nebo přímá bisulfitová sekvenace. Elektrochemie nabízí nenáročné přístrojové vybavení a při použití vhodných elektroaktivních molekul a elektrodových povrchů i několik zajímavých strategií rozlišení cytozinů a metylcytozinů. Obě techniky byly již úspěšně použity při stanovení metylace DNA promotorů důležitých tumor supresorových genů a mohly by tak v budoucnu přispět ke zpřesnění diagnostiky a prognostiky onkologických onemocnění. Aberantní metylace promotorů byla popsána již u stovek genů se vztahem k nádorovým onemocněním a s rozvojem metod, jež by umožňovaly jejich detekci i v klinické praxi, by se řada z nich mohla stát novými důležitými biomarkery.
Cytosine methylation in DNA is an epigenetic mechanism regulating gene expression and plays a vital role in cell differentiation or proliferation. Tumor cells often exhibit aberrant DNA methylation, e.g. hypermethylation of tumor suppressor gene promoters. New methods, capable of determining methylation status of specific DNA sequences, are thus being developed. Among them, MS-HRM (methylation-specific high resolution melting) and electrochemistry offer relatively inexpensive instrumentation, fast assay times and possibility of screening multiple samples/DNA regions simultaneously. MS-HRM is due to its sensitivity and simplicity an interesting alternative to already established techniques, including methylation-specific PCR or bisulfite sequencing. Electrochemistry, when combined with suitable electroactive labels and electrode surfaces, has been applied in several unique strategies for discrimination of cytosines and methylcytosines. Both techniques were successfully tested in analysis of DNA methylation within promoters of important tumor suppressor genes and could thus help in achieving more precise diagnostics and prognostics of cancer. Aberrant methylation of promoters has already been described in hundreds of genes associated with tumorigenesis and could serve as important biomarker if new methods applicable into clinical practice are sufficiently advanced.
- MeSH
- 5-methylcytosin analýza chemie MeSH
- elektrochemie * metody MeSH
- hybridizace nukleových kyselin metody MeSH
- hydrogensulfitreduktasa chemie klasifikace MeSH
- lidé MeSH
- metylace DNA * genetika MeSH
- mutační analýza DNA metody MeSH
- restrikční mapování metody využití MeSH
- teplota MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Vývoj diagnostických a terapeutických přístupů v onkologii vyžaduje, kromě jiného, citlivé kvantitativní přístupy pro stanovení proteinů souvisejících s nádorovými procesy v klinických vzorcích. V tomto článku jsou představeny nové kvantitativní metody cílené proteomiky. Hlavní potenciál metod monitorování vybraných reakcí (SRM) a pseudo‑SRM spočívá v kvantifikaci předem vybraných proteinů ve větších souborech vzorků s vysokou citlivostí a selektivitou, čímž představují alternativu ke stávajícím imunochemickým přístupům. Potenciál HRM a SWATH spočívá naopak v získávání digitálních proteomických fingerprintů, z nichž je následně možné extrahovat kvantitativní proteomická data na podobném principu jako u SRM. Článek představuje aplikace uvedených metod v řadě studií z oblasti onkologického výzkumu, kde byly použity ke stanovení a validaci stávajících i nově navrhovaných proteinových biomarkerů a při studiu jejich úlohy v mechanizmu vzniku a vývoje nádorů.
Development of novel diagnostic and therapeutic approaches in cancer research requires sensitive and quantitative assays for determination of cancer‑associated proteins in clinical samples. Novel quantitative targeted proteomic approaches are overviewed in this communication. A major advantage of selected reaction monitoring (SRM) and pseudo-SRM lies in the selective and sensitive quantification of selected proteins in large sample sets. As such, they represent an alternative to immunochemical approaches. On the other hand, the potential of HRM and SWATH lies in recording of digital fingerprints, which enable post‑acquisition quantitative proteomic data mining on a similar basis to SRM. This article shows applications of targeted proteomics in a number of cancer research studies where they were used for quantification and validation of current or potential protein biomarkers and to study their role in cancer development and progression. Key words: proteomics – selected reaction monitoring – oncology – SWATH – biomarkers – molecular diagnostics This work was supported by the project of Czech Science Foundation No. 14-19250S, by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) and by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805) and BBMRI_CZ (LM2010004). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 3. 2. 2014 Accepted: 26. 3. 2014
- Publikační typ
- abstrakt z konference MeSH
- Klíčová slova
- high resolution melting, HRM, PIK3CA, KRAS, Sangerovo sekvenování,
- MeSH
- adenokarcinom MeSH
- fosfatidylinositol-3-kinasy třídy I MeSH
- geny erbB-1 MeSH
- geny p53 MeSH
- lidé MeSH
- mutace * MeSH
- nádory děložního čípku * diagnóza genetika MeSH
- protoonkogenní proteiny p21(ras) MeSH
- sekvenční analýza DNA MeSH
- spinocelulární karcinom MeSH
- tranzitní teplota MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- abstrakt z konference MeSH
- Publikační typ
- abstrakt z konference MeSH
OBJECTIVES: According to OECD guidelines methods implemented in a diagnostic laboratory should be properly validated prior their implementation. For this purpose we selected genotyping by High Resolution Melting (HRM) of small amplicons using common variants in MTHFR as a model. DESIGN AND METHODS: We selected previously typed samples on which selected analytical validation-related parameters relevant to DNA diagnostics - specificity, sensitivity, precision, robustness and ability to perform reliable calls were evaluated. RESULTS: Correct genotype was assigned in 375/381 (98.4%) for c.677 C>T (rs1801133: C>T; p.A222 V) and in 102/104 (98.1%) for c.1298 A>C (rs1801131: A>C; p.E429A) of all cases. Low analytical failure rate and very high specificity/sensitivity were achieved. Similarly, precision and robustness were consistent. CONCLUSIONS: We have successfully validated HRM of small amplicons using common MTHFR variants as a model. We proved that this technique is highly reliable for routine diagnostics and our diagnostic validation strategy can serve as a model for other applications.
- MeSH
- genetická variace MeSH
- genotyp MeSH
- lidé MeSH
- methylentetrahydrofolátreduktasa (NADPH2) genetika MeSH
- mutační analýza DNA metody přístrojové vybavení MeSH
- reprodukovatelnost výsledků MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- hodnotící studie MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
