Polymerasová řetězová reakce (PCR) je metoda používaná pro namnožení specifického úseku DNA. Pro své vlastnosti se stala tato technika oblíbenou a v praxi hojně používanou metodou. V současné době rozlišujeme tři generace PCR – tradiční PCR (I. generace), kvantitativní PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase – qPCR (II. generace) a digitální PCR – dPCR (III. generace). dPCR je robustní a citlivá metoda, díky čemuž nachází uplatnění v mnoha oblastech jako je mikrobiologie, analýza potravin, onkologie apod. Využívá se především pro absolutní kvantifikaci a/nebo detekci vzácných cílů. Její výhodou je, v porovnání s qPCR, přesnější kvantifikace nezávislá na počtu amplifikačních cyklů a kalibrační křivce.

Polymerase chain reaction (PCR) is a technique used to amplify a specific DNA segment. For its qualities, this technique has become popular and widely used method in practise. Nowaday, we distinguish three generations of PCR – traditional PCR (1st Generation), quantitative PCR with fluorescence detection – qPCR (2nd generation) and digital PCR – dPCR (3rd generation). dPCR is robust and sensitive method, which is applied in many fields such as microbiology, food analysis, oncology, etc. It is mainly used for absolute quantification and / or detection of rare targets. Its advantage, in comparison to qPCR, is more precise quantification independent of the number of amplification cycles and the calibration curve.

• Klíčová slova
• digitální PCR,
• MeSH
• DNA MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
• multiplexová polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• polymerázová řetězová reakce klasifikace   metody   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• techniky amplifikace nukleových kyselin MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Since its invention in 1985 the polymerase chain reaction (PCR) has become a well-established method for amplification and detection of segments of double-stranded DNA. Incorporation of fluorogenic probe or DNA intercalating dyes (such as SYBR Green) into the PCR mixture allowed real-time reaction monitoring and extraction of quantitative information (qPCR). Probes with different excitation spectra enable multiplex qPCR of several DNA segments using multi-channel optical detection systems. Here we show multiplex qPCR using an economical EvaGreen-based system with single optical channel detection. Previously reported non quantitative multiplex real-time PCR techniques based on intercalating dyes were conducted once the PCR is completed by performing melting curve analysis (MCA). The technique presented in this paper is both qualitative and quantitative as it provides information about the presence of multiple DNA strands as well as the number of starting copies in the tested sample. Besides important internal control, multiplex qPCR also allows detecting concentrations of more than one DNA strand within the same sample. Detection of the avian influenza virus H7N9 by PCR is a well established method. Multiplex qPCR greatly enhances its specificity as it is capable of distinguishing both haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes as well as their ratio.

• MeSH
• fluorescenční barviva * MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce * MeSH
• multiplexová polymerázová řetězová reakce přístrojové vybavení   metody   MeSH
• ptačí chřipka u ptáků diagnóza   virologie   MeSH
• ptáci MeSH
• virus chřipky A klasifikace   genetika   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

• MeSH
• analýza určování pohlaví MeSH
• aneuploidie MeSH
• DNA biosyntéza   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• hemofilie A genetika   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• prenatální diagnóza MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Animal or human protothecosis belongs to rather rare, endemic, pro-inflammatory infections. It is caused by achlorophyllous algae of the genus Prototheca. Especially, P. bovis (formerly P. zopfii genotype 2) is often inflected as a non-bacterial causative agent of dairy cattle mastitis. In this study, we present a multiplex real-time PCR (qPCR) system for rapid and exact Prototheca spp. detection and quantification. Limit of detection, diagnostic sensitivity, and specificity were determined. For the first time, specific sequences of AccD (encoding acetyl CoA reductase) for P. bovis, cox1 (encoding cytochrome C oxidase subunit 1) for P. wickerhamii, cytB (encoding cytochrome B) for P. blashkeae and atp6 (encoding transporting ATPase F0 subunit 6) for P. ciferrii (formerly P. zopfii genotype 1) were used for species identification and quantification together with 28S rRNA sequence detecting genus Prototheca. The developed qPCR assay was applied to 55 individual cow milk samples from a herd suspected of protothecosis, 41 bulk milk samples from different Czech farms, 16 boxed milk samples purchased in supermarkets and 21 environmental samples originating from a farm suspected of protothecosis. Our work thus offers the possibility to diagnose protothecosis in the samples, where bacterial mastitis is the most commonly presumed and thereby assisting adequate corrective measures to be taken.

• MeSH
• DNA chemie   izolace a purifikace   MeSH
• farmy MeSH
• klonování DNA MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• limita detekce MeSH
• mikrobiologie životního prostředí MeSH
• mlékárenství MeSH
• mléko mikrobiologie   MeSH
• multiplexová polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• plazmidy genetika   MeSH
• Prototheca genetika   růst a vývoj   izolace a purifikace   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

Cíl studie: Vytvoření a zavedení metodického postupu pro neinvazivní stanovení RHD genotypu plodu z volné fetální DNA cirkulující v periferní krvi těhotné ženy do klinické praxe. Posouzení citlivosti inovované metodiky pomocí ředící řady a vnitřní kontroly amplifikace. Zjištění detekčního limitu minoritního zastoupení RHD+/- genotypu ve vzorku RHD-/-. Typ studie: Prospektivní kohortová a metodologická studie. Název a sídlo pracoviště: Fakultní nemocnice Olomouc: Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny, Porodnicko-gynekologická klinika, transfuzní oddělení. Metodika: TaqMan real-time PCR bez vnitřní kontroly amplifikace. Stanovení prahu citlivosti a kalibrace RHD multiplexu TaqMan real-time PCR multiplexem s vnitřní kontrolou amplifikace a kapilární elektroforézou – minisekvenací (SNaPshot – multiplex) s vnitřní kontrolou amplifikace. Výsledky: RHD pozitivní nebo RHD negativní plod byl určen na základě amplifikačních křivek z real-time PCR systému, které odpovídají stanoveným parametrům pro hodnocení výstupních dat s využitím série kontrol amplifikace a kontaminace. Metody TaqMan real-time PCR systém a minisekvenace byly schopny detekovat 0,22% zastoupení RHD+/- ve vzorku RHD-/-. Minisekvenační systém je vhodný k rozlišení RHD pozitivních homozygotů a heterozygotů. Závěr: V současné době námi zavedený postup založený na detekci exonu 7 genu RHD a sérii paralelních kontrol kontaminace a amplifikace je využívaný v klinické praxi. Obě nově vypracované metody by měly být spolehlivější a po validaci na rozsáhlejším souboru mohou být zavedeny do klinické praxe.

Objective: Introduction of fetal RHD genotyping from cell-free fetal DNA circulating in the peripheral blood of pregnant women to clinical practice. Sensitivity assessment of innovated method using range of dilution series and internal control of amplification. Design: Procedure creating of noninvasive determination of fetal RHD genotyping from blood plasma of pregnant women. Detection of limit of minority representation RHD+/- sample in the RHD-/- sample. Setting: University Hospital Olomouc, Institute of Medical Genetics and Fetal Medicine, Clinic of Obstetrics and Gynecology, Transfusion Department. Methods: TaqMan Real-Time PCR without an internal amplification controls. Optimization and calibration of RHD genotyping using RHD multiplex by TaqMan Real-Time PCR with an internal amplification control and by minisequencing (Snapshot – multiplex) with an internal amplification controls. Results: RHD positive or negative fetuses were determined by amplification curves from Real-Time PCR system that matches the parameters for the evaluation of the output data using series of amplification and contamination parallel controls. TaqMan based Real-Time PCR and minisequencing (SNaPshot) based quantification were able to detect 0.22% of artificial RHD+/- sample diluted in RHD-/- sample. In addition, SNaPshot assay is suitable for heterozygozity and homozygozity recognition. Conclusion: Current established and routinely used procedure is based on the detection of exon 7 of the RHD gene and on the series of parallel amplification and contamination controls. Both newly developed methods could be, after validation of the larger set of control samples, introduced into clinical practice.

• Klíčová slova
• RHD genotypizace, volná fetální DNA, TaqMan real-time PCR, SNaPshot – minisekvenace, minisekvenace, RHD genotypizace – volná fetální DNA – maternální plazma – TaqMan real-time PCR – SNaPshot – minisekvenace, RHD genotyping, cell-free fetal DNA, maternal plasma, minisequencing,
• MeSH
• amplifikace genu genetika   MeSH
• DNA analýza   genetika   krev   MeSH
• elektroforéza kapilární MeSH
• exony genetika   MeSH
• genotyp * MeSH
• kohortové studie MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce * metody   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci plodu diagnóza   MeSH
• plod * MeSH
• polymerázová řetězová reakce * metody   MeSH
• prenatální diagnóza metody   MeSH
• prospektivní studie MeSH
• Rho(D) imunoglobulin * genetika   krev   MeSH
• sekvenční analýza DNA MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví * MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

The hop metabolome important for the brewing industry and for medical purposes is endangered worldwide due to multiple viroid infections affecting hop physiology. Combinatorial biolistic hop inoculation with Citrus bark cracking viroid (CBCVd), Apple fruit crinkle viroid (AFCVd), Hop latent viroid, and Hop stunt viroid (HSVd) showed a low CBCVd compatibility with HSVd, while all other viroid combinations were highly compatible. Unlike to other viroids, single CBCVd propagation showed a significant excess of (-) over (+) strands in hop, tomato, and Nicotiana benthamiana, but not in citruses. Inoculation of hop with all viroids led to multiple infections with unstable viroid levels in individual plants in the pre- and post-dormancy periods, and to high plant mortality and morphological disorders. Hop isolates of CBCVd and AFCVd were highly stable, only minor quasispecies were detected. CBCVd caused a strong suppression of some crucial mRNAs related to the hop prenylflavonoid biosynthesis pathway, while AFCVd-caused effects were moderate. According to mRNA degradome analysis, this suppression was not caused by a direct viroid-specific small RNA-mediated degradation. CBCVd infection led to a strong induction of two hop transcription factors from WRKY family and to a disbalance of WRKY/WDR1 complexes important for activation of lupulin genes.

• MeSH
• Citrus genetika   virologie   MeSH
• Humulus genetika   virologie   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
• Malus genetika   virologie   MeSH
• messenger RNA genetika   MeSH
• ovoce genetika   virologie   MeSH
• tabák genetika   virologie   MeSH
• viroidy genetika   patogenita   MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

INTRODUCTION: Concentration of urinary cell-free DNA (ucfDNA) belongs to potential bladder cancer markers, but the reported results are inconsistent due to the use of various non-standardised methodologies. The aim of the study was to standardise the methodology for ucfDNA quantification as a potential non-invasive tumour biomarker. MATERIAL AND METHODS: In total, 66 patients and 34 controls were enrolled into the study. Volumes of each urine portion (V) were recorded and ucfDNA concentrations (c) were measured using real-time PCR. Total amounts (TA) of ucfDNA were calculated and compared between patients and controls. Diagnostic accuracy of the TA of ucfDNA was determined. RESULTS: The calculation of TA of ucfDNA in the second urine portion was the most appropriate approach to ucfDNA quantification, as there was logarithmic dependence between the volume and the concentration of a urine portion (p = 0.0001). Using this methodology, we were able to discriminate between bladder cancer patients and subjects without bladder tumours (p = 0.0002) with area under the ROC curve of 0.725. Positive and negative predictive value of the test was 90 and 45%, respectively. CONCLUSION: Quantification of ucf DNA according to our modified method could provide a potential non-invasive biomarker for diagnosis of patients with bladder cancer.

• MeSH
• analýza moči normy   MeSH
• bezbuněčný systém MeSH
• DNA analýza   moč   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• nádorové biomarkery moč   MeSH
• nádory močového měchýře diagnóza   moč   MeSH
• prediktivní hodnota testů MeSH
• reprodukovatelnost výsledků MeSH
• ROC křivka MeSH
• senioři MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• studie případů a kontrol MeSH
• Check Tag
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• multicentrická studie MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

In this study, the complete genomic sequence of a novel virus was determined by next-generation sequencing of a sample from a symptomatic strawberry plant with severe yellow spots and mosaic on its leaves. Its genomic organization and sequence showed that this virus is related to members of the proposed insect-specific genus "Negevirus". The sample also contained sequences from the geranium aphid Acyrthosiphon malvae. Although the virus was detected repeatedly in the same plant during the three following years, no other positive samples were obtained from the surroundings or more-distant locations. Reverse transcription qPCR analysis revealed the presence of both genomic positive and complementary negative strands of the viral genome in the sample, with a 3- to 30-fold excess of the positive strand, indicating active viral replication. As the virus was not detected in any insect species collected at this location, the virus was provisionally named "Fragaria vesca-associated virus 1" (FVaV-1).

• MeSH
• fylogeneze MeSH
• genom virový * MeSH
• jahodník virologie   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
• listy rostlin virologie   MeSH
• mšice genetika   MeSH
• nemoci rostlin virologie   MeSH
• RNA virová genetika   MeSH
• rostlinné viry klasifikace   genetika   izolace a purifikace   MeSH
• sekvenční analýza DNA * MeSH
• výpočetní biologie MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

We determined the feasibility of universal fetal marker detection in maternal circulation. Using real-time PCR, we compared the levels of fetal (SRY and hypermethylated RASSF1A) and total (GLO gene and total RASSF1A) extracellular DNA and fractions of extracellular fetal DNA (SRY/GLO vs. hypermethylated RASSF1A/total RASSF1A) in maternal circulation. Sensitivity and specificity reached 100% as the fetal-specific hypermethylated RASSF1A sequence was detected in all 151 examined plasma samples derived from 70 normal pregnancies with a singleton male (n=51) or female (n=19) fetus sampled throughout gestation and absent in non-pregnant individuals (n=29). A strong positive correlation was observed between fetal-derived hypermethylated RASSF1A and SRY (ρ=0.66, P<0.001), total RASSF1A and GLO (ρ=0.65,P<0.001), SRY/GLO vs. hypermethylated RASSF1A/total RASSF1A ratio (ρ=0.62, P<0.001) in maternal plasma. The results indicate that a universal fetal marker could be useful not only for the confirmation of the presence of fetal cell-free DNA in maternal plasma but could enable quantification of cell-free fetal DNA in pregnancy associated disorders, independently of the sex of the fetus.

• MeSH
• alkoholoxidoreduktasy krev   genetika   MeSH
• DNA krev   MeSH
• lidé MeSH
• metylace DNA genetika   MeSH
• nádorové supresorové proteiny krev   genetika   MeSH
• plod MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí MeSH
• prenatální diagnóza metody   MeSH
• protein oblasti určující pohlaví na chromozomu Y krev   genetika   MeSH
• retrospektivní studie MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• těhotenství krev   genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• těhotenství krev   genetika   MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Nejvýznamnějším zdrojem extracelulárních fetálních nukleových kyselin (DNA a RNA) pro účely neinvazivní prenatální diagnostiky jsou apoptotická tělíska trofoblastu. V této práci jsme se zaměřili na studium fragmentace extracelulární DNA přítomné v mateřské cirkulaci u 6 těhotných žen v 16. týdnu gravidity. Fragmentovaná extracelulární DNA byla separována podle délky jednotlivých fragmentů metodou gelové elektroforézy a v jednotlivých sekcích o molekulové hmotnosti 100–300 bp, 300–500 bp, 500–700 bp, 700–900bp, > 900 bp byla stanovena koncentrace fetální a celkové směsné DNA pomocí PCR v reálném čase s využitím specifických primerů a TaqMan sond pro SRY a GLO geny. Fetální DNA byla detekována pouze ve fragmentech o molekulové hmotnosti 100–300 bp a 300–500 bp. Největší koncentrace fetální DNA se vyskytovala v sekci o molekulové hmotnosti 100–300 bp, kde dosáhla hodnot 14,8 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 1,56–83,2). V sekci o molekulové hmotnosti 300–500 bp bylo detekováno menší množství fetální DNA o koncentracích 1,53 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 0–10,8). V sekcích o molekulové hmotnosti 500–700 bp, 700–900 bp a > 900 bp nebyla fetální DNA detekována. Fetální DNA byla ve frakci o molekulové hmotnosti 100–300 bp 4,8násobně zkoncentrována (rozpětí 0krát–16,6krát) ve srovnání s fetální DNA přítomnou v neseparované extracelulární DNA, která se po izolaci z mateřské plazmy používá pro detekci paternálních alel u plodu. Pokud se zaměříme na izolaci DNA o velikosti fragmentů 100–300 bp, získáme koncentrovanější ale nikoliv purifikovanou fetální DNA. Obsah fetální DNA v této frakci činil 1,15 % (rozpětí 0,16–8,0) ve srovnání s neseparovanou extracelulární DNA, kde podíl fetální DNA tvořil pouze 0,29 % (rozpětí 0,06–1,78). Z naší studie je zřejmé, že metoda koncentrace fetální DNA pomocí separace fragmentované extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy prostřednictvím gelové elektroforézy není vhodná pro rutinní účely.

Apoptotic bodies derived from placental trophoblasts represent the most important source of extracellular fetal nucleic acids (DNA and RNA) for the purpose of non-invasive prenatal diagnosis. In this work we studied the fragmentation of extracellular DNA present in maternal circulation of 6 pregnant women within 16th week of gestation. Extracellular DNA was separated by using agarose gel electrophoresis size-fractionation. Fetal and total circulatory DNA was quantified in individual fractions with an approximate size of 100–300 bp, 300–500 bp, 500–700 bp, 700–900bp, > 900 bp by using real-time PCR, specific primers and TaqMan probes for SRY and GLO genes. Fetal circulatory DNA was mainly detected in section with a size 100–300 bp with the concentration of 14.8 GE/ml (range 1.56–83.2). Lower amount of fetal circulatory DNA, 1.53 GE /ml (range 0–10.8), was also found in a fraction with a size 300–500 bp. No fetal DNA was detected in fractions with an approximate size of 500–700 bp, 700–900 bp and more than 900 bp. Circulatory DNA extracted from the gel fragment with a molecular size less than 300 bp contained 4.8 x (range 0x–16.6x) enriched fetal DNA when compared with initial unseparated DNA sample, which has been usually used to detect fetal paternally inherited alleles. If we focused on isolation of DNA with a size of 100–300 bp, we could get more concentrated but not purified fetal DNA. The median percentage of foetal derived DNA in this fraction was 1.15 % (range 0.16–8.0). However median percentage of fetal derived DNA in unseparated extracellular DNA was 0.29 % (range 0.06–1.78). Our experience revealed that the usage of enriched size-fractionated fetal DNA is not suitable for routine clinical applications.

• MeSH
• apoptóza genetika   imunologie   MeSH
• DNA analýza   diagnostické užití   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• fragmentace DNA genetika   MeSH
• geny pro imunoglobuliny imunologie   MeSH
• geny sry genetika   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   MeSH
• prenatální diagnóza MeSH
• těhotenství - specifické beta-1-glykoproteiny analýza   diagnostické užití   genetika   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH