immuno-assay Dotaz Zobrazit nápovědu
84 s. : il. ; 24 cm
- Konspekt
- Fyziologie člověka a srovnávací fyziologie
- NLK Obory
- endokrinologie
- biochemie
Transfer RNAs acquire a large plethora of chemical modifications. Among those, modifications of the anticodon loop play important roles in translational fidelity and tRNA stability. Four human wobble U-containing tRNAs obtain 5-methoxycarbonylmethyluridine (mcm5U34) or 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine (mcm5s2U34), which play a role in decoding. This mark involves a cascade of enzymatic activities. The last step is mediated by alkylation repair homolog 8 (ALKBH8). In this study, we performed a transcriptome-wide analysis of the repertoire of ALKBH8 RNA targets. Using a combination of HITS-CLIP and RIP-seq analyses, we uncover ALKBH8-bound RNAs. We show that ALKBH8 targets fully processed and CCA modified tRNAs. Our analyses uncovered the previously known set of wobble U-containing tRNAs. In addition, both our approaches revealed ALKBH8 binding to several other types of noncoding RNAs, in particular C/D box snoRNAs.
Tato práce popisuje zavedení a optimalizaci metody umožňující analýzu produkce prozánětlivých cytokinů buňkami vrozené imunity. Diagnos-tika autoinflamatorních onemocnění, jako jsou familiární středozemní horečka (Familial Mediterranean Fever, FMF), syndrom Schnitzlerové či hyper IgD syndrom (HIDS), imunodysregulačních a autoimunitních onemocnění s autoinflamatorní složkou, je často složitá pro nespecifický klinický obraz. Přesná diagnóza je možná až genetickým vyšetřením, které však není u všech pacientů průkazné a u některých onemocnění ani není genetický původ znám. Nejasnosti v diagnostice onemocnění a rozlišení patogenetických pochodů u konkrétních pacientů ztěžují či zcela znemožňují nastavení cílené terapie, která v současné době zahrnuje i možnosti specifické blokády jednotlivých prozánětlivých cytokinů. Z tohoto důvodu jsme se zaměřili na zavedení, nastavení a optimalizaci metody, která by umožnila rychle a ekonomicky v malém množství lehce dostupného biomateriálu (periferní krve) odhalit aberantní produkci vybraných prozánětlivých cytokinů, a přispěla by tak ke správné diagnostice a výběru vhodné terapie. Produkce základních prozánětlivých cytokinů (IL-1β, IL-6, TNFα) tvořených zejména monocyty po stimulaci lipopo-lysacharidem (LPS) byla v práci testována pomocí dvou rozdílných metod – průtokovou cytometrií detekující intracelulární produkci cytokinů a metodou ALBIA (Addressable Laser Bead Immuno Assay) – Luminex, která umožňuje stanovení množství cytokinů uvolněných do superna-tantu. Na zdravých dárcích byla optimalizována délka stimulace, koncentrace LPS a čas zastavení uvolňování cytokinů z buněk Brefeldinem A.
This work aims at the introduction and optimization of methods for innate immune parameters analysis with a detailed focus on proinflammatory cytokines. Autoinflammatory diseases like Familial Mediterranean Fever (FMF), Schnitzler syndrome and Hyper-IgD syndrome (HIDS), as well as autoimmune diseases that involve the inflammatory component, are usually characterized by a non-specific clinical manifestation. Therefore, obtaining a proper diagnosis of these disorders remains complicated. Genetic examination serves as an accurate diagnostic method for the esta-blishment of monogenic autoinflammatory disease diagnosis. However, genetic profiling cannot be provided to all patients. Moreover, some of the mutations responsible for the development of the disease haven’t been defined yet. Therapy of inflammatory diseases is currently based on molecules that are capable of blocking the function of inflammatory cytokines. In inflammatory diseases, the proper understanding of disease pathogenesis is still far from satisfactory and therefore, selecting the right therapeutic treatment modality keeps causing difficulties. For this reason, we focused on the introduction and optimization of a novel method which has a potential to detect activation of inflammatory cytokines and may, therefore, contribute to the correct diagnosis and direct therapeutic strategy. Production of main proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNFα), which are produced by monocytes after lipopolysaccharide stimulation, was tested with two different methods – flow cytometry, detecting the intracellular production of cytokines, and ALBIA (Addressable Laser Bead Immuno Assay) - Luminex method, which can detect extracellular cytokine release into supernatant. Using flow cytometry we optimized the setting by detecting the optimal time of stimulation, concentration of LPS and the optimal time to stop cytokine exocytosis after adding Brefeldin A.
- Klíčová slova
- metoda Luminex,
- MeSH
- analýza dat MeSH
- časové faktory MeSH
- cytokiny * imunologie krev MeSH
- horečka neznámého původu * diagnóza genetika imunologie MeSH
- lidé MeSH
- průtoková cytometrie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
Cíl práce: Porovnání senzitivity a specificity dvou komerčních testů na stanovení Clostridium difficile GDH (glutamát dehydrogenázy) a toxinů A/B. Materiál a metodiky: Bylo testováno 86 stolic pacientů hospitalizovaných ve FN Motol. GDH a toxiny A/B byly paralelně vyšetřovány dvěma testy: C. difficile Quik Chek Complete?, Techlab,USA) a Liaison? C. difficile GDH a Toxins AαB (DiaSorin USA). Současně byly ze stolic izolovány nukleové kyseliny pomocí UltraClean? Fecal DNA (MoBio Laboratories, USA). Pro metodu PCR byla použita komerční souprava C. difficile Elite MGB? kit (Nanogen, Itálie). Anaerobní kultivace na selektivním médiu pro C. difficile (Oxoid) proběhla u všech vzorků vykazující pozitivitu alespoň jednoho testu. Čisté izoláty byly molekulárně analyzovány ribotypizací. Výsledky: GDH a toxin A/B negativních oběma metodami bylo 36 vzorků (42 %). GDH a toxin pozitivních oběma metodami bylo 20 vzorků (23 %). GDH pozitivních a toxin negativních oběma metodami, ale PCR pozitivních bylo 9 vzorků (10 %). GDH pozitivních a toxin negativních oběma metodami a PCR negativních bylo 11 vzorků (13 %). GDH pozitivní, toxin pozitivní pouze testem Liaison? bylo 6 vzorků (7 %). GDH pozitivní pouze Liaison? byly 4 vzorky (5 %). K selhání kultivace došlo u 11 vzorků (13), z toho u 7 vzorků byl pozitivní test PCR. PCR reakce byla inhibována v 5 případech (6 %). Zachycené ribotypy toxigenní: AI-3, 001, 002, 012,014, 017, 020, 049, 054, 078, 176, 203, 413 a netoxigenní: AI-34, AI-61, 010, 485, 495, 596. Závěr: Stanovení toxinu A/B testem Liaison? vykazuje u námi vyšetřeného souboru o 7 % vyšší senzitivitu. Dvoukrokové uspořádání testů také přináší ekonomickou úsporu, která může být využita např. k zavedení PCR metod do diagnostického algoritmu laboratoře.
Study objective: Comparison of two commercially available tests for the detection of Clostridium difficile Glutamate Dehydrogenase (GDH) and toxins A and B for their sensitivity and specificity. Material and methods: Eighty-six stool samples from patients hospitalised in the Motol University Hospital were analysed. GDH and toxins A and B were assayed in parallel by two tests: C. difficile Quik Chek Complete? (Techlab, USA) and Liaison? C. difficile GDH and Toxins AαB (DiaSorin, USA). From the stool samples, nucleic acids were also isolated using the UltraClean? Fecal DNA kit (MoBio Laboratories, USA). The commercially available C. difficile Elite MGB? kit (Nanogen, Italy) was used for the polymerase chain reaction (PCR). Anaerobic culture on C. difficile selective medium (Oxoid) was performed for all positive samples at least in one test. Pure isolates were characterized by PCR ribotyping. Results: Thirty-six (42%) samples were GDH negative and toxin A/B negative by both tests. Twenty (23%) samples were GDH positive and toxin A/B positive by both tests. Nine (10%) samples were GDH positive and toxin negative by both tests, but were positive by PCR. Eleven (13%) samples that were GDH positive and toxin negative by both tests remained negative by PCR. Six (7%) samples only were GDH positive and toxin positive by the Liaison? test alone. Four (5%) samples were GDH-positive by theLiaison? test alone. Culture failure was observed in 11 (13%) samples, of which seven were positive by PCR. PCR was inhibited in five (6%) samples. The following toxigenic ribotypes: AI-3, 001, 002, 012,014, 017, 020, 049, 054, 078, 176, 203, and 413 and non-toxigenic ribotypes: AI-34, AI-61, 010, 485, 495, and 596 were identified. Conclusion: The Liaison? test had seven percent higher sensitivity for the detection of toxins A/B. The two-step protocol of the tests is also cost-saving. The savings can be used e.g. for incorporating the PCR techniques into the diagnostic algorithm of the laboratory.
- MeSH
- antigeny bakteriální analýza MeSH
- Clostridioides difficile * enzymologie chemie izolace a purifikace MeSH
- feces mikrobiologie MeSH
- glutamátdehydrogenasa imunologie MeSH
- imunoenzymatické techniky metody využití MeSH
- klostridiové infekce * diagnóza genetika mikrobiologie MeSH
- lidé MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- srovnávací studie MeSH
- MeSH
- AIDS diagnóza etiologie farmakoterapie MeSH
- dospělí MeSH
- HIV infekce diagnóza etiologie farmakoterapie MeSH
- klinické laboratorní techniky metody MeSH
- lidé MeSH
- mikrobiální testy citlivosti MeSH
- Mycobacterium izolace a purifikace MeSH
- Check Tag
- dospělí MeSH
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- kazuistiky MeSH
- MeSH
- fluorescenční protilátková technika nepřímá MeSH
- imunoelektronová mikroskopie MeSH
- izoenzymy metabolismus MeSH
- krysa rodu rattus MeSH
- myokard enzymologie MeSH
- sodíko-draslíková ATPasa metabolismus MeSH
- srdce růst a vývoj MeSH
- western blotting MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- krysa rodu rattus MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- zvířata MeSH
