BACKGROUND: Testicular germ cell tumors (TGCT) are unique malignancies of young adult men; their biology is, however, underexplored and there has not been much progress in their treatment for decades. Circulating free tumor DNA (cfDNA) analysis represents a promising way of discovering novel diagnostic and treatment options. OBJECTIVE: The study evaluates the clinical value of cfDNA detection in TGCT patients. DESIGN AND METHODS: Total cfDNA concentration and ratio of its 2 main fragments (180 and 360 bp) were evaluated by spectrophotometry, capillary electrophoresis and qPCR in peripheral blood plasma of 96 TGCT patients (173 samples) and 31 normal controls. Non-parametric tests were used for statistical analyses. RESULTS: The total cfDNA concentration was significantly higher in TGCT than in controls (P < 0.0001), with the highest levels at disease progression, but with no clear threshold between malignant and normal samples. Patients with positive tumor markers had higher cfDNA concentrations than those with negative markers (P = 0.01). Longer 360 bp cfDNA fragments were found in 58% of TGCT patients including almost all samples from relapse or disease progression but no normal controls (P < 0.0001). CONCLUSION: Total cfDNA levels are significantly increased in TGCT patients but without a clear threshold separating normal and tumor samples, thus total cfDNA amount itself is not a sensitive enough marker to identify or monitor TGCT. Longer cfDNA fragments have been found exclusively in a proportion of tumors and predominantly at disease progression, representing a novel potential marker for TGCT monitoring that would deserve further exploration.
- MeSH
- cirkulující nádorová DNA * MeSH
- germinální a embryonální nádory * MeSH
- lidé MeSH
- mladý dospělý MeSH
- nádorové biomarkery MeSH
- progrese nemoci MeSH
- testikulární nádory * MeSH
- volné cirkulující nukleové kyseliny * MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mladý dospělý MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Cíl studie: Zhodnocení kaskádového vyšetření metodami kvantitativní fluorescenční PCR (QF-PCR – quantitative fluorescence PCR) a SNP array (single nucleotide polymorphism array) při identifikaci chromozomálních abnormalit u potracených plodů. Soubor a metodika: V průběhu let 2018–2020 bylo v laboratořích Gennetu zpracováno 1 094 vzorků potracených plodů. Standardní schéma kaskádového vyšetření zahrnovalo screening základních aneuploidií metodou QF-PCR setem Omnibor (STR markery 13, 18, 21, X a Y), setem SAB-nadstavba I (STR markery 2, 7, 15, 16, 22), setem SAB-nadstavba II (od listopadu 2019, STR markery 4, 6, 14) a následně vyšetření metodou SNP array (Illumina). U všech vzorků bylo provedeno ověření/vyloučení maternální kontaminace. Výsledky: Po vyloučení maternální kontaminace (32 % vzorků) bylo metodou QF-PCR vyšetřeno 742 vzorků, 469 (63,2 %) z nich mělo negativní nález a 273 (36,8 %) patologický nález. Vzorky 469 plodů s negativním QF-PCR nálezem byly následně vyšetřeny metodou SNP array. Normální ženský/mužský profil byl potvrzen u 402 plodů (85,7 %), chromozomální aneuploidie a velké chromozomální aberace (delece/duplikace > 10 Mb) u 51 vzorků (10,9 %). U 16 (3,4 %) vyšetřených plodů byla nalezena mikrodelece nebo mikroduplikace, ve dvou případech se jednalo o patogenní mikrodelece a ve 14 o variantu nejasného významu bez přímé souvislosti s abortem. Byl potvrzen statisticky významný vyšší záchyt chromozomálních aberací u plodů žen s věkem > 35 let. Mezi skupinami vyšetřených abortů u gravidit po spontánní koncepci a po in vitro fertilizaci nebyl prokázán statisticky významný rozdíl. Závěr: Kaskádovým vyšetřením metodami QF-PCR a SNP array byla objasněna genetická příčina u 43 % všech vyšetřených abortů. Záchyt chromozomálních abnormalit u časných abortů v I. trimestru byl 50,4 %.
Objective: The evaluation of quantitative fluorescence PCR (QF-PCR) and single nucleotide polymorphism array (SNP array) analysis for the identification of chromosomal abnormalities in products of conception (POC). Materials and methods: A total of 1,094 POC samples were processed at Gennet in the years 2018–2020. Chromosomal aneuploidies were tested by QF-PCR using a Omnibor set (STR markers 13, 18, 21, X a Y), SAB-I set (STR markers 2, 7, 15, 16, 22), SAB-II set (from November 2019, STR markers 4, 6, 14) followed by SNP array analysis (Illumina) on samples with a negative QF-PCR result. All POC samples were tested for maternal contamination. Results: After exclusion of maternal contamination (32% samples) the total number of 742 POC samples were tested by QF-PCR. Chromosomal aneuploidies were found in 273 POC samples (36.8%). Then, 469 QF-PCR negative POC samples were tested by SNP array analysis. Normal female/male profile was confirmed in 402 samples (85.7%) and chromosomal aneuploidies and chromosomal aberrations (deletion/duplication > 10 Mb) in 51 samples (10.9%). Microdeletion/microduplication was found in 16 POC samples (3.4%), two were classified as pathogenic variants and 14 as variants of unknown significance. In a group of women > 35 years of age, statistically significant increase of the chromosomal abnormalities was confirmed. No statistically significant difference between the in vitro fertilization group and the group of spontaneous conception was found. Conclusion: The application of the molecular work-up based on the stepwise use of QF-PCR and SNP array clarifies the cause of the abortion in 43% POC samples. The overall detection rate in the I. trimester was 50.4%.
- MeSH
- buněčné klony MeSH
- buňky K562 MeSH
- CRISPR-Cas systémy MeSH
- genový knockout MeSH
- homozygot MeSH
- hyperhomocysteinemie farmakoterapie genetika MeSH
- kultivované buňky MeSH
- kyselina listová terapeutické užití MeSH
- lidé MeSH
- megaloblastová anemie farmakoterapie genetika MeSH
- mladiství MeSH
- posunová mutace MeSH
- recidiva MeSH
- sekvenční delece MeSH
- sekvenování exomu MeSH
- sodíko-vodíkový výměnný transportér 1 nedostatek genetika MeSH
- vitamin B 12 terapeutické užití MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mladiství MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- dopisy MeSH
- kazuistiky MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
The emergence of cisplatin (CDDP) resistance is the main cause of treatment failure and death in patients with testicular germ cell tumors (TGCT), but its biologic background is poorly understood. To study the molecular basis of CDDP resistance in TGCT we prepared and sequenced CDDP-exposed TGCT cell lines as well as 31 primary patients' samples. Long-term exposure to CDDP increased the CDDP resistance 10 times in the NCCIT cell line, while no major resistance was achieved in Tera-2. Development of CDDP resistance was accompanied by changes in the cell cycle (increase in G1 and decrease in S-fraction), increased number of acquired mutations, of which 3 were present within ATRX gene, as well as changes in gene expression pattern. Copy number variation analysis showed, apart from obligatory gain of 12p, several other large-scale gains (chr 1, 17, 20, 21) and losses (chr X), with additional more CNVs found in CDDP-resistant cells (e.g., further losses on chr 1, 4, 18, and gain on chr 8). In the patients' samples, those who developed CDDP resistance and died of TGCT (2/31) showed high numbers of acquired aberrations, both SNPs and CNVs, and harbored mutations in genes potentially relevant to TGCT development (e.g., TRERF1, TFAP2C in one patient, MAP2K1 and NSD1 in another one). Among all primary tumor samples, the most commonly mutated gene was NSD1, affected in 9/31 patients. This gene encoding histone methyl transferase was also downregulated and identified among the 50 most differentially expressed genes in CDDP-resistant NCCIT cell line. Interestingly, 2/31 TGCT patients harbored mutations in the ATRX gene encoding a chromatin modifier that has been shown to have a critical function in sexual differentiation. Our research newly highlights its probable involvement also in testicular tumors. Both findings support the emerging role of altered epigenetic gene regulation in TGCT and CDDP resistance development.
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
Genová editace je považována za největší pokrok v molekulárně genetických metodách od objevu polymerázové řetězové reakce. Díky této technologii dnes můžeme provádět cílené změny v nukleotidové sekvenci DNA s mnohem větší přesností a účinností, než bylo doposud možné. Využití nachází genová editace téměř ve všech biotechnologických oborech, neboť výrazně zjednodušuje studium funkce genů a biologických procesů. Nejpopulárnějším nástrojem genové editace je tzv. systém CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR Associated Protein 9), který si díky své relativně snadné konstrukci a vysoké účinnosti vydobyl výsadní postavení v molekulární biologii a jeho ohromný potenciál se již začíná uplatňovat i v translační medicíně. Cílem tohoto souhrnného článku je představení genové editace a shrnutí nejvýznamnějších aplikací této unikátní technologie ve výzkumu, diagnostice a léčbě hematologických onemocnění.
Genome editing is considered to be the biggest advance in molecular genetics since the discovery of the polymerase chain reaction. This method enables the introduction of changes in a target DNA sequence with unprecedented accuracy and efficiency. Since it greatly facilitates the study of genes and biological processes, it has been employed in basic research across all biotechnology fields. The CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR Associated Protein 9) system is the most widely used genome-editing platform. Due to its relatively easy construction and high efficiency, this system has revolutionized the field of molecular biology and also holds enormous potential in translational medicine. The aim of this review is to introduce genome-editing technique and summarize the most important applications of this unique technology in research, diagnostics and treatment of haematologic diseases.
- MeSH
- CRISPR-Cas systémy * MeSH
- editace genu metody MeSH
- genetické nemoci vrozené genetika terapie MeSH
- krevní nemoci * diagnóza genetika terapie MeSH
- lidé MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
Východiska: Testikulární germinální nádory (testicular germ cell tumors – TGCT) jsou nejčastější solidní malignitou mladých mužů, se zvyšující se incidencí v posledních desetiletích. V jejich etiologii se uplatňuje kombinace faktorů vnějšího prostředí i genetických predispozic z oblastí několika genomových lokusů, postihujících jak testikulární germinální buňky, tak buňky stromální a jejich interakce v rámci daného mikroprostředí. Patogeneze TGCT začíná již v prenatálním období zablokováním vývoje primordiálních germinálních buněk a pokračuje postnatálně přes in situ nádorovou lézi k invazivnímu tumoru s charakteristickou amplifikací krátkého raménka chromozomu 12. Kromě genů lokalizovaných zde se v patogenezi TGCT uplatňují další molekulární mechanizmy jako aktivace dráhy KIT/KITL, aberace v genech účastnících se oprav poškozené DNA a regulujících diferenciaci, proliferaci a přežívání buněk. I přes poměrně dobrou prognózu a relativně známou etiopatogenezi těchto nádorů se u nich neuplatňuje žádná biologická léčba ani žádné molekulárně-genetické prediktivní či prognostické faktory. Nedostatek informací se vztahuje především ke konkrétním molekulárním drahám zapojeným do vzniku TGCT, na jejichž složky by bylo možné biologickou léčbou cíleně působit. Současné vysokokapacitní technologie jako sekvenování nové generace na exomové i transkriptomové úrovni by měly doplnit chybějící informace o genetických predispozicích vzniku TGCT a dalších faktorech zodpovědných za jejich klinický průběh a odpověď na léčbu. Cíl: V tomto přehledu jsou shrnuty hlavní dosud známé molekulární charakteristiky TGCT a pravděpodobné mechanizmy účastnící se jejich vzniku a progrese.
Background: Testicular germ cell tumors (TGCT) are the most frequently diagnosed solid tumors in young men and their incidence has been increasing over the past decades. Several factors may combine and play a role in the TGCT etiology, including environmental factors and genetic predispositions at multiple genomic loci that affect both testicular germ cells and stromal cells, and their interactions within the testicular microenvironment. The pathogenesis of TGCT starts prenatally with primordial germ cell arrest, and further proceeds postnatally, giving rise to in situ germ cell neoplasia and, finally, to invasive TGCT with the characteristic 12p chromosome amplification. Apart from the genes localized here, further molecular mechanisms have been linked to TGCT pathogenesis, such as the activation of the KIT/KITL signaling pathway, and aberrations in genes involved in DNA reparation, regulation of cellular differentiation, proliferation, and survival. Despite the relatively good prognosis and known etiopathogenesis of these tumors, neither targeted therapy nor molecular prognostic/predictive factors have yet been implemented in the management of TGCT, because there is not enough information about the molecular pathways or molecules involved in TGCT development that could be used for patient stratification and treatment. Current high-throughput technologies, such as next generation sequencing at the exome or transcriptome level could provide this missing information on genetic predispositions and other factors influencing the clinical course of the disease and treatment response in TGCT. Aim: In this review, we summarize the main molecular characteristics of TGCT and the probable mechanisms participating in tumor initiation and progression.
- Klíčová slova
- molekulární aberace, prediktivní faktory,
- MeSH
- germinální a embryonální nádory etiologie genetika MeSH
- lidé MeSH
- prognóza MeSH
- signální transdukce MeSH
- testikulární nádory * etiologie genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
PURPOSE: Wilms tumor gene 1 (WT1), a zinc-finger transcription factor essential for testis development and function, along with other genes, was investigated for their role in the pathogenesis of testicular germ cell tumors (TGCT). METHODS: In total, 284 TGCT and 100 control samples were investigated, including qPCR for WT1 expression and BRAF mutation, p53 immunohistochemistry detection, and massively parallel amplicon sequencing. RESULTS: WT1 was significantly (p < 0.0001) under-expressed in TGCT, with an increased ratio of exon 5-lacking isoforms, reaching low levels in chemo-naïve relapsed TGCT patients vs. high levels in chemotherapy-pretreated relapsed patients. BRAF V600E mutation was identified in 1% of patients only. p53 protein was lowly expressed in TGCT metastases compared to the matched primary tumors. Of 9 selected TGCT-linked genes, RAS/BRAF and WT1 mutations were frequent while significant TP53 and KIT variants were not detected (p = 0.0003). CONCLUSIONS: WT1 has been identified as a novel factor involved in TGCT pathogenesis, with a potential prognostic impact. Distinct biologic nature of the two types of relapses occurring in TGCT has been demonstrated. Differential mutation rate of the key TGCT-related genes has been documented.
- MeSH
- down regulace MeSH
- fenotyp MeSH
- genetická predispozice k nemoci MeSH
- geny ras * MeSH
- germinální a embryonální nádory enzymologie genetika patologie MeSH
- imunohistochemie MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
- lidé MeSH
- mutace * MeSH
- mutační analýza DNA metody MeSH
- nádorové biomarkery genetika MeSH
- nádorové buněčné linie MeSH
- nádorový supresorový protein p53 genetika MeSH
- prospektivní studie MeSH
- proteiny WT1 genetika MeSH
- protoonkogenní proteiny B-raf genetika MeSH
- protoonkogenní proteiny c-kit genetika MeSH
- retrospektivní studie MeSH
- studie proveditelnosti MeSH
- testikulární nádory enzymologie genetika patologie MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
