The aim of this study was to optimise a two-tube reverse transcription triplex quantitative real time PCR (qRT-PCR) combining amplification of two loci with an internal amplification control (IAC) for detection and quantitation of hepatitis E virus (HEV) RNA and to validate its performance on a pool of biological samples. Optimisation was performed on serially diluted "home-made" RNA standards. The limit of detection was determined experimentally as 10 copies/μl of the RNA standard for both amplification targets. The qRT-PCR was validated on a cohort of samples originating from 48 wild boars (Sus scrofa), 17 fallow deer (Dama dama) and 28 mouflons (Ovis musimon), with nested RT-PCR used as a reference method. qRT-PCR was found to be more specific for the detection of HEV RNA in examined samples. HEV RNA was detected in samples of five more animals (one wild boar and four mouflons) in comparison with nested RT-PCR.
- MeSH
- hepatitida E diagnóza veterinární virologie MeSH
- ovce virologie MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody normy MeSH
- reprodukovatelnost výsledků MeSH
- RNA virová analýza genetika normy MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- Sus scrofa virologie MeSH
- virus hepatitidy E genetika MeSH
- vysoká zvěř virologie MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- hodnotící studie MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Článek přehledově pojednává o významu molekulární diagnostiky chronické myeloidní leukemie, molekulárního monitorování účinnosti léčby, zbytkové nemoci a rezistence na terapii a role Národní referenční laboratoře ÚHKT v těchto oblastech vyšetřování. Kvalitativní detekce založená na multiplexové reverzně transkriptázové PCR potvrzuje přítomnost mRNA fúzního genu BCR-ABL ve vyšetřovaném vzorku, a tedy diagnózu chronické myeloidní leukemie. Charakterizace typu přestavby je rovněž významná pro následující monitorování nemoci, které probíhá na úrovni kvantifikace transkriptů BCR-ABL. Kvantitativní stanovování BCR-ABL transkriptů probíhá v pravidelných intervalech a umožňuje sledovat kinetiku nemoci v průběhu léčby na molekulární úrovni. Milníkem úspěšného managementu léčby chronické myeloidní leukemie inhibitory tyrozinových kináz je dosažení velké molekulární odpovědi, která odpovídá úrovni BCR-ABL transkriptů ≤ 0,1 %IS. Tudíž zcela zásadní je sjednocování kvantifikace BCR-ABL mezi laboratořemi, které probíhá na národní a mezinárodní úrovni. Celosvětově je v současné době intenzivně řešena otázka definice a monitorování kompletní molekulární remise, resp. míry hluboké molekulární odpovědi, jelikož s nástupem nové generace léčiv se vyšší procento pacientů dostává do molekulární remise. Nejvíce probádaným a jasně prokázaným mechanizmem rezistence na léčbu TKI jsou mutace kinázové domény v BCR-ABL. Sangerovo sekvenování je zlatým standardem pro rutinní detekci a charakterizace BCR-ABL mutací. V současnosti se do popředí zájmu dostává sekvenování 2. generace, od kterého se očekává možné objasnění vzniku mutací a klonálního vývoje pod tlakem TK inhibitorů a případné dopady této extrémně citlivé technologie na prognózu.
This overview discusses an importance of molecular diagnostics of chronic myeloid leukemia, molecular monitoring of treatment efficacy, residual disease and resistance to therapy and the role of the National reference laboratory ÚHKT in these issues. The qualitative detection based on the multiplex reverse transcriptase PCR confirms the presence of mRNA of the fusion gene BCR-ABL in the examined sample, thus a diagnosis of chronic myeloid leukemia. Characterization of the type of BCR-ABL rearrangement is also important for the subsequent monitoring based on the quantification of BCR-ABL transcripts. The quantitative determination of BCR-ABL transcripts at regular intervals monitors the kinetics of the disease during the treatment at the molecular level. A milestone in the successful management of chronic myeloid leukemia by tyrosine kinase inhibitors is the achievement of the major molecular response, which corresponds to the levels of BCR-ABL transcripts ≤ 0.1%IS. Thus, a fundamental aim is national and international harmonization of BCR-ABL transcripts quantification among laboratories. Currently, definition and monitoring of the complete molecular remission or deep molecular response rates is currently intensively studied worldwide, because of a higher number of patients achieving complete molecular response under 2nd generation TKI. The most studied and proved mechanism of the resistance to TKI therapy are mutations in the kinase domain of BCR-ABL. Sanger sequencing is the gold standard for the routine detection and characterization of BCR-ABL mutations. At present, mutation studies starting with using of the second-generation sequencing, which is expected to help in understanding of mutation development and clonal evolution under the pressure of TK inhibitors and the potential impact of this extremely sensitive technology for the prognosis.
- Klíčová slova
- Sangerovo sekvenování, sekvenování 2. generace, Sangerovo sekvenování, rezistence, real-time RT-PCR, multiplex RT-PCR, kvantifikace, inhibitory tyrozinových kináz, CMR, BCR-ABL,
- MeSH
- bcr-abl fúzní proteiny genetika krev MeSH
- časové faktory MeSH
- chemorezistence genetika MeSH
- chronická myeloidní leukemie * diagnóza farmakoterapie genetika MeSH
- genetická transkripce MeSH
- inhibitory proteinkinas * terapeutické užití MeSH
- laboratoře normy MeSH
- lidé MeSH
- messenger RNA genetika MeSH
- mutace genetika MeSH
- nádorové biomarkery genetika MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody normy MeSH
- referenční standardy MeSH
- regulace genové exprese u leukemie MeSH
- řízení kvality MeSH
- sekvenční analýza metody MeSH
- tyrosinkinasy antagonisté a inhibitory MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
We performed a gene expression study using RT-qPCR in Staphylococcus aureus. The influence of normalization method was investigated. We confirmed that a recent standard, using more reference genes, was the best normalization strategy. The application of the most commonly used reference genes in 2011 (gyrB and 16S rRNA gene) failed.
- MeSH
- bakteriální geny MeSH
- bakteriální RNA genetika MeSH
- DNA gyráza genetika MeSH
- exprese genu MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce normy MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí normy MeSH
- referenční standardy MeSH
- RNA ribozomální 16S genetika MeSH
- Staphylococcus aureus genetika MeSH
- transkriptom MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
A quantitative PCR, real-time RT-PCR, and one-step real-time RT-PCR using SYBR Green-based tools for reliable detection and relative quantitation of Prune dwarf virus (PDV) in stone fruits are described. The assay reliability was tested on 55 samples from different hosts and regions. The sensitivity of the assay was also compared with other assays with different primers. Two plant-expressed genes, actin and 18S rRNA, were used as housekeeping genes for accurate quantitation of PDV in stone fruit trees. The expression of the gene for actin and the 18S ribosomal RNA gene corresponded with each other accurately, with standard deviation values of 1.905 cycles on average, 1.36 for Prunus persica, and 2.45 for other Prunus species tested. The results of this study support the need to use more than one housekeeping gene as an internal control to avoid possible errors caused by unstable internal control gene mRNA expression when quantifying the extent of PDV infection.
- MeSH
- aktiny genetika MeSH
- barvení a značení metody MeSH
- fluorescenční barviva MeSH
- Ilarvirus genetika izolace a purifikace MeSH
- organické látky MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody normy MeSH
- referenční standardy MeSH
- RNA ribozomální 18S genetika MeSH
- RNA rostlin genetika MeSH
- RNA virová genetika MeSH
- rostlinné proteiny genetika MeSH
- slivoň virologie MeSH
- virová nálož MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
BACKGROUND: For accuracy of quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), normalisation with suitable reference genes is required. To date, no reference genes have been validated for expression studies of bronchoalveolar (BAL) cells. The aims of this study were to identify gene(s) with stable mRNA expression in BAL cells irrespective of gender, smoking, BAL cellular composition, lung pathology, treatment; and to assess the influence of reference genes on target gene expression data. RESULTS: The mRNA expression of ten housekeeping genes (ACTB, ARF1, CANX, G6PD, GAPDH, GPS1, GNB2L1, PSMB2, PSMD2, RPL32) was investigated by qRT-PCR in BAL cells from 71 subjects across a spectrum of lung diseases. The analyses were validated in an independent BAL cohort from 63 sarcoidosis patients and 17 control subjects. A second derivative method was used to calculate expression values (CTt); an equivalence test, applets BestKeeper, geNorm and NormFinder were applied to investigate gene expression stability. Of the investigated genes, PSMB2 (CTt +/- SD, 23.66 +/- 0.86) and RPL32 (18.65 +/- 0.92) were the most stable; both were constantly expressed in BAL samples from parallel investigated cohorts irrespective of evaluated variables. Finally, to demonstrate effect of traditional (ACTB/GAPDH) and novel (PSMB2/RPL32) reference genes as denominators, expression of two cytokines known associated with sarcoidosis was investigated in sarcoid BAL cells. While normalization with PSMB2/RPL32 resulted in elevated IFNG mRNA expression (p = 0.004); no change was observed using GAPDH/ACTB (p > 0.05). CCL2 mRNA up-regulation was observed only when PSMB2/RPL32 were used as denominators (p < 0.03). CONCLUSION: PSMB2 and RPL32 are, therefore, suitable reference genes to normalize qRT-PCR in BAL cells in sarcoidosis, and other interstitial lung disease.
- MeSH
- bronchy cytologie MeSH
- dospělí MeSH
- financování organizované MeSH
- kouření genetika MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- messenger RNA analýza MeSH
- mladiství MeSH
- plicní alveoly cytologie MeSH
- plicní nemoci genetika MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí normy MeSH
- referenční standardy MeSH
- sarkoidóza genetika MeSH
- stanovení celkové genové exprese normy MeSH
- studie případů a kontrol MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- dospělí MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mladiství MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- hodnotící studie MeSH
- MeSH
- chemorezistence fyziologie MeSH
- fluoruracil farmakologie MeSH
- kolorektální nádory enzymologie genetika MeSH
- lidé MeSH
- messenger RNA analýza MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody normy MeSH
- thymidylátsynthasa analýza antagonisté a inhibitory genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- srovnávací studie MeSH
- MeSH
- buňky kostní dřeně genetika patologie MeSH
- Ewingův sarkom genetika patologie MeSH
- fúzní onkogenní proteiny genetika MeSH
- lidé MeSH
- lidské chromozomy, pár 22 genetika patologie MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody normy statistika a číselné údaje MeSH
- reziduální nádor diagnóza genetika MeSH
- translokace genetická MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
