Cílem práce bylo porovnání dosažených výsledků molekulárních metod využívaných v Oddělení bakteriálních vzdušných nákaz (OBVN) CEM SZÚ pro účely detekce, identifikace a typizace bakterií Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae a Haemophilus influenzae v klinických (kultivačně negativních) vzorcích při podezření na uvedená invazivní bakteriální onemocnění. OBVN nabízí využití molekulární diagnostiky uvedených bakteriálních původců menigitid a sepsí z klinických vzorků již řadu let. Spektrum metod se však změnilo. Z původní polymerázové řetězové reakce s elektroforetickým vyhodnocením (seminested PCR) k real-time polymerázové řetězové reakci (rt-PCR). Bylo provedeno souběžné srovnání obou metodik na 56 klinických vzorcích, které ukazuje lepší výsledky rt-PCR oproti seminested PCR.

The aim was to compare the outcomes of molecular methods used in the Unit for Airborne Bacterial Infections (UABI) for the detection, identification, and typing of the bacteria Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae from clinical culture-negative specimens of patients with suspected invasive bacterial infection. The UABI has been providing molecular diagnosis of the above-mentioned bacterial pathogens from clinical specimens of patients with meningitis or sepsis for years. However, the range of the methods used has changed: the UABI switched from the polymerase chain reaction (PCR) with reading of the results by elecrophoresis (seminested PCR) to the real-time polymerase chain reaction (rt-PCR). The outcomes of the two methods were compared using 56 clinical specimens, with rt-PCR proving superior to seminested PCR

• Keywords
• seminested PCR, rt-PCR,
• MeSH
• Molecular Diagnostic Techniques methods   statistics & numerical data   MeSH
• Haemophilus influenzae isolation & purification   MeSH
• Real-Time Polymerase Chain Reaction statistics & numerical data   MeSH
• Neisseria meningitidis isolation & purification   MeSH
• Polymerase Chain Reaction * methods   statistics & numerical data   MeSH
• Streptococcus pneumoniae isolation & purification   MeSH
• Bacterial Typing Techniques methods   statistics & numerical data   MeSH
• Publication type
• Comparative Study MeSH

Cíl práce: Molekulární epidemiologie je oborem, který využívá výsledky typizačních technik k získání informací o detailní charakteristice bakteriálních kmenů umožňujících stanovit identitu, příbuznost nebo odlišnost bakterií stejného rodu, druhu, případně i sérotypu. V současnosti jsou nejvíce používány metody založené na sledování rozdílu v genotypu bakterií. Většina těchto technik je ovšem časově i finančně náročná. Do rutinní praxe mikrobiologických laboratoří se ale rozšiřuje i metoda založená na analýze bakteriálního proteomu - hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí/ionizací za účasti matrice s použitím průletového analyzátoru (MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS). Je využívána zejména k rychlému a přesnému zařazení bakterií do rodu i druhu. Cílem naší práce proto bylo posoudit možnost využití této metody k typizaci kampylobakterů pod úroveň druhu a aplikaci výsledků při epidemiologických šetřeních. Materiál a metody: Do studie bylo zahrnuto 39 kmenů Campylobacter jejuni izolovaných z potravin (16) nebo humánního původu (23). U kmenů bylo provedeno stanovení makrorestrikčních profilů metodou pulzní gelové elektroforézy (PFGE) a současně také analýza proteinových profilů s využitím metody MALDI-TOF MS. Výsledky: Vyhodnocení míry podobnosti pulzních profilů prokázalo shody mezi izoláty pocházejícími ze stejné epidemie nebo z opakovaných odběrů jednoho pacienta. Dále byly detekovány stejné pulzní profily u kmenů bez známé spojitosti, ale se shodným místem původu a rokem izolace. Z porovnání shlukových analýz obou metod vyplývá, že kmeny označené metodou PFGE jako shodné se V dendrogramu MALDI-TOF MS objevují v jedné podskupině s výjimkou kmenů z opakovaného odběru stejného pacienta. Závěr. Naše výsledky ukazují, že potvrzení identity nebo příbuznosti kmenů v souladu se zjištěnými epidemiologickými skutečnostmi se zatím metodou MALDI-TOF nepodařilo jednoznačně prokázat.

Objectives: Molecular epidemiology is a field that uses results of typing techniques to obtain information on detailed characterization of bacterial strains for determining the identity, similarity or difference in bacteria of the same genus, species or serotype. Nowadays, the most commonly used methods are based on monitoring differences in bacterial genotypes. However, most of these techniques are time-consuming and costly. A method increasingly used in routine microbiological testing is matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), which is based on analysis of the bacterial proteome. It is mainly used for rapid and accurate classification of bacteria into genera and species. The aims were to assess the potential use of this method for typing of Campylobacter below the species level and to apply these results in epidemiological investigations. Material and Methods: The study comprised 39 strains of Campylobacter jejuni isolated from food (16) and humans (23). Macrorestriction fragment profiling by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and simultaneous protein profile analysis using MALDI-TOF MS were performed for all tested strains. Results: Similar pulse profiles were found among isolates originating from the same outbreak or repeatedly collected from a single patient. The same pulse profiles were also detected in strains of unknown relationship but sharing the same place of origin and year of isolation. The comparison of dendrograms from both analyses showed that strains identified as identical by PFGE appeared in the same subgroups in dendrograms obtained by MALDI-TOF MS, the only exception being isolates repeatedly collected from a single patient. Conclusion: The results suggest that confirmation of the identity or similarity of strains in accordance with the established epidemiological facts has not been clearly demonstrated using MALDI-TOF MS.

• Keywords
• MALDI-TOF MS,
• MeSH
• Campylobacter jejuni * isolation & purification   MeSH
• Humans MeSH
• Pilot Projects MeSH
• Electrophoresis, Gel, Pulsed-Field statistics & numerical data   MeSH
• Cluster Analysis MeSH
• Spectrometry, Mass, Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization * statistics & numerical data   MeSH
• Bacterial Typing Techniques methods   statistics & numerical data   utilization   MeSH
• Check Tag
• Humans MeSH
• Publication type
• Evaluation Study MeSH
• Research Support, Non-U.S. Gov't MeSH
• Comparative Study MeSH

Zavedli jsme metodu detekce chromozomální DNA Treponema pallidum subsp. pallidum dvoukrokovou (nested) PCR reakcí, která amplifikuje část genu TP0319, kódujícího hypotetický membránový lipoprotein (gen tmpC). Vyšetřili jsme 138 sér od 111 dospělých pacientů v primárním, sekundárním, časně latentním a pozdně latentním stadiu a také pacientů s podezřením na syfilis. Chromozomální DNA T. p. pallidum se v séru dospělých pacientů nepodařilo detegovat. Při vyšetření 11 kožních a slizničních stěrů (7 genitálních, 4 faryngeálních) jsme nalezli 6 pozitivních od 3 pacientů ve stadiu primární a sekundární syfilis. Pozitivní byl rovněž jeden stěr pacienta s časnou kongenitální syfilis. Sekvenování DNA genů TP0136 a TP0548 z pozitivních vzorků prokázalo výskyt dvou kmenů sekvenčně identických s kmenem T. p. pallidum SS14 a dvou unikátních syfilitických kmenů, doposud u T. p. pallidum nepopsaných. U jednoho vyšetřovaného novorozence s pozitivním výsledkem vyšetření kožního vzorku jsme prokázali treponemální DNA také v séru a v cerebrospinálním moku. Pokroky v molekulární typizaci T. p. pallidum v klinickém materiálu přispějí k rozvoji epidemiologie syfilis a přinesou možnosti rozlišení mezi reinfekcí a reaktivací syfilitického procesu.

An in-house two-step nested PCR amplification targeting the tmpC gene (TP0319, encoding putative membrane lipoprotein) was used for detection of chromosomal DNA of Treponema pallidum subsp. pallidum in clinical specimens.We tested 138 blood serum samples from 111 adult patients with suspected, primary, secondary, early or late latent syphilis. T. p. pallidum DNA was not detected in any of the analyzed specimens. Out of 11 mucocutaneous swabs (7 genital and 4 pharyngeal), 6 collected from 3 patients with primary or secondary syphilis tested positive. One skin swab from a patient with early congenital syphilis was also positive as were his serum and cerebrospinal fluid samples. DNA sequencing of the genes TP0136 and TP0548 from the positive samples revealed two strains with DNA sequences identical to that of T. p. pallidum strain SS14 and two unique previously undescribed T. p. pallidum strains. The advances in molecular typing of T. p. pallidum in clinical specimens will be of relevance to the epidemiology of syphilis and will allow for clinical discrimination between reinfection and syphilitic reactivation.

• MeSH
• Molecular Diagnostic Techniques methods   statistics & numerical data   utilization   MeSH
• Research Support as Topic MeSH
• Humans MeSH
• Specimen Handling classification   methods   statistics & numerical data   MeSH
• Polymerase Chain Reaction classification   methods   statistics & numerical data   MeSH
• Base Sequence drug effects   MeSH
• Bacterial Typing Techniques methods   statistics & numerical data   utilization   MeSH
• Treponema pallidum genetics   isolation & purification   classification   MeSH
• Check Tag
• Humans MeSH
• Male MeSH
• Female MeSH
• Publication type
• Comparative Study MeSH