Východiska: Chromosomální translokace zahrnující imunoglobulinové lokusy (14q32/IGH, 2p11/IGK a 22q11/IGL) hrají důležitou roli v patogenezi B-buněčných leukémií a lymfomů. Jejich výsledkem je deregulace transkripce onkogenů zahrnutých do těchto translokací, která je způsobená jejich juxtapozicí s IGH transkripčními enhancery. Pro identifikaci nádorových genů lokalizovaných v blízkosti zlomových míst chromosomových translokací lze použít fluorescenční in situ hybridizaci (FISH). Nicméně běžně užívaná mapovací strategie metodou FISH vyžaduje velký počet experimentů se sondami vybranými ze zkoumané oblasti a spotřebuje značné množství cytogeneticky zpracovaného nádorového materiálu. Jedním z alternativních přístupů je array komparativní genomická hybridizace (aCGH), rychlá technika na úrovni DNA, která používá jen malé množství nádorového materiálu. Narozdíl od metody FISH však dovoluje určit pouze nebalancované změny. Cílem této práce bylo ukázat, že aCGH je efektivní nástroj k rychlému mapování zlomových míst nereciprokých IGH translokací u B-buněčných leukémií a lymfomů. Materiál a metody. Pro tuto studii jsme vybrali jednoho pacienta s B-buněčnou chronickou lymfocytární leukémií (CLL) s komplexním karyotypem a nebalancovanou translokací der(14)t(1; 14)(q25;q32) zahrnující IGH. Ke genomickému profilování tohoto případu jsme použili metodu aCGH s rozlišením 1 megabáze (Mb). Validace výsledků aCGH byla provedena pomocí metafázové FISH s BAC klony a celochromosomovými malovacími sondami. Výsledky a závěry. Během jednoho aCGH experimentu bylo identifikováno osm aberantních oblastí (4 zmnožení a 4 ztráty genetického materiálu). Podle našeho očekávání tyto abnormality zahrnovaly také duplikaci 1q zahrnuté do tranlokace der(14)t(1;14). Byly identifikovány dva po sobě následující BAC klony ohraničující zlomové místo v oblasti 1q21.3. Tyto klony byly posléze použity pro metafázovou FISH, která potvrdila aCGH nález. Navzdory 1 Mb rozlišení použitého chipu, byly od sebe tyto dva konkrétní klony odděleny oblastí přibližně 3 Mb velkou. Vzhledem k tomu, že v této oblasti se vyskytuje velké množství genů, je k identifikaci kandidátního genu ležícího v oblasti zlomu nezbytné další mapování za pomocí BAC klonů, a CGH výsledky nám navíc pomohly opravit původní cytogenetický nález a přesně určit změny karyotypu u tohoto pacienta. Naše data poskytují další důkaz toho, že aCGH je efektivní technika pro molekulární karyotypování nádorů a umožňuje rychlé mapování genomických změn, včetně zlomových míst nereciprokých translokací. Ty mohou být detekovány s vysokou přesností a citlivostí během jediného experimentu, jak ukazuje naše práce.
Background: Chromosomal translocations involving immunoglobulin loci (14q32/IGH, 2p11/IGK and 22q11/IGL) play an important role in pathogenesis of B cell leukemia and lymphoma. These aberrations lead to deregulated transcription of targeted oncogenes by their juxtaposition with the IGH transcriptional enhancer(s). Fluorescent in situ hybridization (FISH) showed to be a potential tool for identification of cancer-related genes located in breakpoint regions of chromosomal translocations. However, the commonly used „probe-mapping“ FISH strategy requires numerous experiments with consecutively selected probes from the narrowed down region and uses a significant amount of cytogenetic material. One of the alternative approaches, array comparative genomic hybridisation (aCGH), is a rapid technique that operates on DNA level and uses only a small amount of tumor material. In contrast to FISH, however, it analyzes only unbalanced aberrations. The aim of this study was to evaluate array comparative genomic hybridisation (aCGH) as a potential tool for a rapid mapping of breakpoint of non- reciprocal IGH-associated translocation in B cell leukemia and lymphoma. Material and methods. For this study, we selected one case of B cell chroniclymphocytic leukemia (CLL) with a complex karyotype including unbalanced der(14)t(1;14)(q25;q32) involving IGH. Genomic profiling of this case was performed using 1 megabase (Mb) aCGH. Validation of aCGH results was done by metaphase FISH with Bacterial Artificial Chromosome (BAC) clones and chromosome painting probes. Results and conclusions. In one single aCGH experiment eight regions of genomic imbalances (4 gains and 4 losses) were identified. As expected, these imbalances included also duplication of 1q due to the der(14)t(1;14). Two consecutive BAC clones flanking the proximal breakpoint at 1q21.3 have been identified. These clones were further applied for metaphase FISH analysis that confirmed aCGH findings. Despite of 1 Mb resolution of the applied platform, these particular clones are separated by approximately 3 Mb. Given that this region is gene-rich, further BAC-mapping is required to identify the candidate gene located in the breakpoint region. Moreover, aCGH data helped us to correct original cytogenetic findings and precisely define karyotypic changes in this case. Our data provide additional evidence that aCGH is a powerful technique for molecular karyotyping of tumors and allows a rapid mapping of genomic imbalances, including breakpoints of non-reciprocal translocations. As shown in this study, the latter can be detected with high accuracy and sensitivity during a single experiment.
- MeSH
- Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell diagnosis etiology genetics MeSH
- Financing, Organized MeSH
- Genetic Research MeSH
- Genes, Immunoglobulin genetics MeSH
- Hybridization, Genetic MeSH
- In Situ Hybridization, Fluorescence methods utilization MeSH
- Nucleic Acid Hybridization genetics methods MeSH
- Medical Oncology methods trends MeSH
- Humans MeSH
- Lymphoma diagnosis etiology genetics MeSH
- Oncogenes genetics immunology MeSH
- Aged MeSH
- Comparative Genomic Hybridization MeSH
- Translocation, Genetic genetics MeSH
- Chromosomes, Artificial, Bacterial genetics MeSH
- DNA Breaks MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
- Male MeSH
- Aged MeSH
- Keywords
- aCGH, fluorescenční in situ hybridizace,
- MeSH
- Myelodysplastic Syndromes MeSH
- Publication type
- Abstracts MeSH
Mnohočetný myelom (MM) je hematologické onemocnění způsobené maligní proliferací klonálních plazmatických buněk (PCs), které se vyznačuje značnou klinickou a biologickou variabilitou. Identifikace chromozomových změn v genomu PCs hraje klíčovou roli v patogenezi MM a má také důležitý prognostický význam u pacientů s MM. Z genetického hlediska lze MM rozdělit na dva subtypy. Hyperdiploidní MM (H-MM), který se vyskytuje u 50 % případů, je charakterizován častou incidencí trizomií chromozomů 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 a 21 a dále nízkým výskytem translokací IgH. Téměř polovina případů je klasifikována jako non-hyperdiploidní MM (NH-MM), u kterého lze často najít jednu z pěti rekurentních translokací IgH: 4p16 (FGFR3 a MMSET), 6p21 (CCND3), 11q13 (CCND1), 16q23 (MAF), 20q12 (MAFB) a který je asociován s nepříznivou prognózou onemocnění. Rozvoj a rozšířené využívání nových technologií, jako je technika celogenomové komparativní genomové hybridizace na oligonukleotidových čipech (aCGH), výrazně posunula výzkum genomových změn u MM, jelikož umožňuje v rámci jedné reakci analýzou chromozomových změn v celém genomu, a tak představuje ideální nástroj pro studium nádorové genetiky a je vhodnou aplikací pro rutinní analýzy v klinické praxi. Technika aCGH významně překonává běžně používané cytogenetické techniky (G-pruhování, FISH), a to jak v možnostech minimálního rozlišení chromozomových změn, tak i v kvalitě a množství získaných genomických dat nezbytných pro další analýzy a klinické aplikace. Technika aCGH je nyní používána k lepšímu pochopení molekulárního fenotypu nádorových buněk, pro studium vlivu chromozomových změn na citlivost na určitá chemoterapeutika a prognózu onemocnění. Tento dokument přináší stručný metodický a literární přehled použití techniky oligonukleotidové aCGH v diagnostice MM.
Multiple myeloma (MM) is a hematological disease caused by malignant proliferation of clonal plasma cells (PCs) known for its clinical and biological heterogeneity. Identification of chromosomal changes in genome of PCs plays a key role in MM pathogenesis and is supposed to have important prognostic significance for MM patients. There are two major genetic entities in MM. Hyperdiploid tumors (H-MM), which include about 50% of MM tumors, often have multiple trisomies involving chromosomes 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, and 21 and a substantially lower prevalence of IgH translocations. Nearly half of tumors are non-hyperdiploid (NH-MM), and mostly have one of five recurrent IgH translocations: 11q13 (CCND1), 6p21 (CCND3), 16q23 (MAF), 20q12 (MAFB), and 4p16 (FGFR3 and MMSET). The development and expanded use of new technologies, such as genome-wide array-based comparative genomic hybridization (aCGH) has accelerated genomic research in MM. This technique is a powerful tool to globally analyze recurrent copy number changes in tumor genome in a single reaction and to study cancer biology and clinical behaviors. It widely overcame routinely used cytogenetic techniques (G-banding, FISH) both in minimal resolution of chromosomal changes and amount of obtained genomic data important for further analyses and clinical applications. Array CGH technique is now used to better understanding of molecular phenotypes, sensitivity to particular chemotherapeutic agents, and prognosis of these diseases. This paper brings brief literature and methodic overview of oligonucleotide-based array-CGH technique in MM diagnosis.
Cíl studie: Syndrom Noonanové (NS), jedna z nejčastějších RASopatií, má odhadovanou incidenci 1 z 1000 až 2500 živě narozených jedinců. V prenatálním období lze u postižených plodů s tímto syndromem pozorovat zvýšené šíjové projasnění, hygroma colli, hydrops plodu, vrozené srdeční vady, vady ledvin, lymfatické vaky nebo větší množství plodové vody. U plodů s těmito nálezy byla při nálezu normálního karyotypu a po vyloučení mikrodelečních/mikroduplikačních syndromů doplněna prenatální diagnostika i o vyšetření vybraných genů pro RASopatie. Cílem studie bylo zhodnotit klinický přínos masivně paralelního sekvenování (MPS, massively parallel sequencing) DNA plodů suspektních pro NS, tj. diagnostickou výtěžnost na jedné straně a podíl detekovaných variant nejasného významu na straně druhé. Typ studie: Klinicky diagnostická. Název a sídlo pracoviště: Centrum prenatální diagnostiky, Brno, s.r.o.; Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o. Metodika: Analyzovány byly vzorky plodových vod, resp. choriových klků. Z nich izolovaná DNA byla po zjištění normálního karyotypu a array-CGH (aCGH) postoupena k analýze genů asociovaných s RASopatiemi metodou MPS. Výsledky: Ve sledovaném dvouletém období byl NS potvrzen celkem u 10 z 95 vyšetřovaných plodů. To představuje 10,5% diagnostickou výtěžnost metody. Celkem u 10 plodů byla detekována varianta DNA nejasného významu (VOUS, variants of unknown significance), následná segregační analýza pomohla objasnit její význam u šesti plodů. Závěr: MPS umožňuje rychlou molekulárně-genetickou diagnostiku RASopatií již v prenatálním období. Tato metoda tak přispívá k objasnění nejen fenotypových projevů u již narozených jedinců, ale také ultrazvukových nálezů u plodů s normálním karyotypem i aCGH.
Objective: Noonan syndrome (NS), one of the most common RASopathies, has an estimated incidence of 1 in 1,0002,500 live births. In the prenatal period increased nuchal translucency, hygroma colli, hydrops fetus, congenital heart disease, kidney defects, larger amount of amniotic fluid can be observed in affected fetuses with this syndrome. In the fetuses with normal karyotype and no microdeletion/microduplication syndromes the examination of selected genes for RASopathies was added. The aim of the study was to evaluate the clinical benefit of massively parallel sequencing (MPS) of susceptible fetal DNA for NS, i.e., the diagnostic yield on the one hand and the proportion of detected variants of unknown significance (VOUS) on the other. Design: Clinically diagnostic. Setting: Centrum prenatální diagnostiky, Brno, s.r.o; Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o. Methods: Samples of amniotic fluid or chorionic villus were analyzed. Selected genes associated with RASopathies were analyzed in case of the negative result of karyotype and array-CGH. A panel of twenty genes was investigated by MPS. Results: In the two-years period, Noonan syndrome was detected in 10 from 95 investigated fetuses. This represents a 10.5% diagnostic efficiency of the method. DNA variants of unknown significance were detected in 10 fetuses. A segregation analysis helped to clarify their meaning in six fetuses. Conclusion: MPS allows fast molecular-genetic diagnosis of RASopathies already in the prenatal period. This method contributes to the clarification not only of phenotypic manifestations in already born individuals but also of ultrasound findings in fetuses with both normal karyotype and aCGH.
- Keywords
- cystický hygrom,
- MeSH
- Hydrops Fetalis MeSH
- Pregnancy Complications MeSH
- Humans MeSH
- Nuchal Translucency Measurement methods MeSH
- Noonan Syndrome * diagnosis MeSH
- Prenatal Diagnosis * methods MeSH
- Retrospective Studies MeSH
- Pregnancy MeSH
- Heart Defects, Congenital diagnosis MeSH
- High-Throughput Nucleotide Sequencing methods MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
- Pregnancy MeSH
- Female MeSH
Molecular-cytogenetic methods were used to analyse and specify complex genome rearrangements in malignant cells. Twelve samples of bone marrow cells were collected from patients with myelodysplastic syndromes (MDS). The complex karyotypes were examined by multicolour fluorescence in situ hybridization (mFISH), high-resolution multicolour banding (mBAND) and array comparative genomic hybridization (aCGH). For aCGH, DNA was isolated from fixed bone marrow cells in methanol and acetic acid and amplified by whole-genome amplification. Three samples were analysed by the oligonucleotide array NimbleGen on the basis of full service. BAC-based Haematochips (BlueGnome) were used for the other nine samples. Sensitivity and detection limits of both methods were compared. The results obtained by mFISH/mBAND were in most cases confirmed by the microarray technique. aCGH detected 43 unbalanced chromosomal changes that were also identified by classical cytogenetics and FISH. Moreover, aCGH discovered 14 additional changes. Cryptic amplifications and deletions were characterized with a resolution of 0.5 Mb. In one bone marrow sample with suspected monosomy 5 detected by conventional cytogenetic analysis, aCGH revealed a 22.3 Mb region of chromosome 5 inserted in another autosome within the complex karyotype. Amplified DNA was successfully used for aCGH in 11 out of 12 cases, improving resolution of unbalanced chromosomal aberrations. The combination of both approaches brought more detailed description of complex karyotypes and is highly recommended.
- MeSH
- Cytogenetics methods instrumentation MeSH
- Adult MeSH
- Financing, Organized MeSH
- Gene Rearrangement MeSH
- In Situ Hybridization, Fluorescence MeSH
- Karyotyping methods MeSH
- Humans MeSH
- Chromosomes, Human, Pair 5 MeSH
- Myelodysplastic Syndromes genetics MeSH
- Comparative Genomic Hybridization methods instrumentation MeSH
- Check Tag
- Adult MeSH
- Humans MeSH
Characteristic recurrent copy number aberrations (CNAs) play a key role in multiple myeloma (MM) pathogenesis and have important prognostic significance for MM patients. Array-based comparative genomic hybridization (aCGH) provides a powerful tool for genome-wide classification of CNAs and thus should be implemented into MM routine diagnostics. We demonstrate the possibility of effective utilization of oligonucleotide-based aCGH in 91 MM patients. Chromosomal aberrations associated with effect on the prognosis of MM were initially evaluated by I-FISH and were found in 93.4% (85/91). Incidence of hyperdiploidy was 49.5% (45/91); del(13)(q14) was detected in 57.1% (52/91); gain(1)(q21) occurred in 58.2% (53/91); del(17)(p13) was observed in 15.4% (14/91); and t(4;14)(p16;q32) was found in 18.6% (16/86). Genome-wide screening using Agilent 44K aCGH microarrays revealed copy number alterations in 100% (91/91). Most common deletions were found at 13q (58.9%), 1p (39.6%), and 8p (31.1%), whereas gain of whole 1q was the most often duplicated region (50.6%). Furthermore, frequent homozygous deletions of genes playing important role in myeloma biology such as TRAF3, BIRC1/BIRC2, RB1, or CDKN2C were observed. Taken together, we demonstrated the utilization of aCGH technique in clinical diagnostics as powerful tool for identification of unbalanced genomic abnormalities with prognostic significance for MM patients.
- MeSH
- Genome-Wide Association Study * MeSH
- Chromosome Aberrations * MeSH
- Adult MeSH
- Middle Aged MeSH
- Humans MeSH
- Multiple Myeloma diagnosis genetics MeSH
- Neoplasm Proteins genetics MeSH
- Prognosis MeSH
- Aged, 80 and over MeSH
- Aged MeSH
- Comparative Genomic Hybridization methods MeSH
- Check Tag
- Adult MeSH
- Middle Aged MeSH
- Humans MeSH
- Male MeSH
- Aged, 80 and over MeSH
- Aged MeSH
- Female MeSH
- Publication type
- Journal Article MeSH
- Clinical Trial MeSH
- Multicenter Study MeSH
- Research Support, Non-U.S. Gov't MeSH
- Geographicals
- Czech Republic MeSH
