The EU-supported EuroFlow Consortium aimed at innovation and standardization of immunophenotyping for diagnosis and classification of hematological malignancies by introducing 8-color flow cytometry with fully standardized laboratory procedures and antibody panels in order to achieve maximally comparable results among different laboratories. This required the selection of optimal combinations of compatible fluorochromes and the design and evaluation of adequate standard operating procedures (SOPs) for instrument setup, fluorescence compensation and sample preparation. Additionally, we developed software tools for the evaluation of individual antibody reagents and antibody panels. Each section describes what has been evaluated experimentally versus adopted based on existing data and experience. Multicentric evaluation demonstrated high levels of reproducibility based on strict implementation of the EuroFlow SOPs and antibody panels. Overall, the 6 years of extensive collaborative experiments and the analysis of hundreds of cell samples of patients and healthy controls in the EuroFlow centers have provided for the first time laboratory protocols and software tools for fully standardized 8-color flow cytometric immunophenotyping of normal and malignant leukocytes in bone marrow and blood; this has yielded highly comparable data sets, which can be integrated in a single database.

• MeSH
• hematologické nádory diagnóza   imunologie   MeSH
• imunofenotypizace normy   MeSH
• laboratoře normy   MeSH
• lidé MeSH
• monoklonální protilátky diagnostické užití   MeSH
• nádorové biomarkery imunologie   MeSH
• prognóza MeSH
• průtoková cytometrie přístrojové vybavení   metody   normy   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH
• Geografické názvy
• Evropa MeSH

Flow cytometric immunophenotyping has become essential for accurate diagnosis, classification, and disease monitoring in hemato-oncology. The EuroFlow Consortium has established a fully standardized "all-in-one" pipeline consisting of standardized instrument settings, reagent panels, and sample preparation protocols and software for data analysis and disease classification. For its reproducible implementation, parallel development of a quality assurance (QA) program was required. Here, we report on the results of four consecutive annual rounds of the novel external QA EuroFlow program. The novel QA scheme aimed at monitoring the whole flow cytometric analysis process (cytometer setting, sample preparation, acquisition and analysis) by reading the median fluorescence intensities (MedFI) of defined lymphocytes' subsets. Each QA participant applied the predefined reagents' panel on blood cells of local healthy donors. A uniform gating strategy was applied to define lymphocyte subsets and to read MedFI values per marker. The MedFI values were compared with reference data and deviations from reference values were quantified using performance score metrics. In four annual QA rounds, we analyzed 123 blood samples from local healthy donors on 14 different instruments in 11 laboratories from nine European countries. The immunophenotype of defined cellular subsets appeared sufficiently standardized to permit unified (software) data analysis. The coefficient of variation of MedFI for 7 of 11 markers performed repeatedly below 30%, average MedFI in each QA round ranged from 86 to 125% from overall median. Calculation of performance scores was instrumental to pinpoint standardization failures and their causes. Overall, the new EuroFlow QA system for the first time allowed to quantify the technical variation that is introduced in the measurement of fluorescence intensities in a multicentric setting over an extended period of time. EuroFlow QA is a proficiency test specific for laboratories that use standardized EuroFlow protocols. It may be used to complement, but not replace, established proficiency tests. © 2014 International Society for Advancement of Cytometry.

• MeSH
• imunofenotypizace metody   MeSH
• leukemie klasifikace   diagnóza   MeSH
• lymfom klasifikace   diagnóza   MeSH
• podskupiny lymfocytů imunologie   MeSH
• průtoková cytometrie metody   MeSH
• referenční hodnoty MeSH
• referenční standardy MeSH
• řízení kvality MeSH
• zdraví dobrovolníci pro lékařské studie MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• Geografické názvy
• Evropa MeSH

Technologický rozvoj průtokové cytometrie (flow cytometry, FC) spolu s nejnovějšími poznatky z oblasti imunofenotypizace monoklonálních gamapatií (MG) odhalil nezbytnost tohoto vyšetření zejména pro jeho diagnostický, prognostický a prediktivní význam. Cílem Evropské myelomové sítě (European Myeloma Network, EMN) je standardizovat tuto analytickou metodu a zařadit ji mezi rutinní klinická vyšetření. Jelikož celkový význam a možné aplikace FC jsou stále analyzovány, je zřejmé, že standardizace může napomoci zisku relevantních klinických výstupů z oblasti patofyziologie MG.

The technological development of flow cytometry (FC) together with new findings reveal the need for immunophenotyping in research of monoclonal gammopathy (MG) because of its diagnostic, prognostic and predictive significance. The aim of the European Myeloma Network (EMN) is to standardize this analytical method and implement it into routine clinical examination. Since the overall significance and application of FC are still analysed, standardisation could help obtain more clinical relevant information in terms of MG pathophysiology.

• Klíčová slova
• plazmatická buňka,
• MeSH
• CD antigeny analýza   MeSH
• financování organizované MeSH
• imunofenotypizace MeSH
• lidé MeSH
• mnohočetný myelom MeSH
• paraproteinemie imunologie   patologie   MeSH
• plazmatické buňky imunologie   klasifikace   MeSH
• průtoková cytometrie metody   normy   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

Projekt si klade za cíl zavést 8-mi barevnou standardizovanou cytometrickou diagnostiku hematologických malignit v návaznosti na evropský projekt Euroflow. Jednotně provedená diagnostika navíc umožní komputační zpracování dat a hledání prognostických vztahů v multicentrických souborech. Důležitou součástí projektu je vývoj jednotného postupu detekce odpovědi na léčbu (stanovení minimální reziduální nemoci), a zavedení metodiky externí kontroly kvality stanovení. Projekt je navržen jako projekt multicentrický se zastoupením 4 významných diagnostických center tak, aby bylo zajištěno dostatečné zastoupení všech klinických skupin hematologických malignit.; We expect end up with standardized 8-color flow cytometry for diagnosing and disease monitoring of various hematological malignancies as currently is within the Euroflow project under the development. Uniformly performed diagnostics across the centers inCzechia will enable searching new prognostic correlations and computer assisted diagnostic evaluation. Important part of the project is the development of minimal residual disease detection on common basis which will also enable inter-laboratory standardization and quality data control. Four centers focused on different patients group agreed in participation in the project and all disease categories are covered within these center.

• MeSH
• hematologické nádory diagnóza   prevence a kontrola   MeSH
• imunofenotypizace MeSH
• metody pro podporu rozhodování MeSH
• plošný screening MeSH
• průtoková cytometrie metody   normy   přístrojové vybavení   trendy   MeSH
• referenční standardy MeSH
• reziduální nádor MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• hematologie a transfuzní lékařství
• onkologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

BACKGROUND: Multiple myeloma (MM) is characterized by accumulation of pathological plasma cells (PCs) in bone marrow (BM) as a result of deregulation of B-cell development. To clarify its pathophysiology it is necessary to investigate in detail the developmental stages of B-cells. MATERIALS AND METHODS: Enumeration of total CD19-positive (CD19(+)) cells and their subpopulations together with PCs was done in peripheral blood (PB) and BM of newly diagnosed monoclonal gammopathy patients and control subjects. Representation of subsets was compared among groups and relationships between subset percentage and cytogenetic/biochemical findings were analyzed. RESULTS: A lower number of total CD19(+) cells was found in MM, particularly in advanced stages of disease. Reduction of naive (P < .01) and transitional B-cells (P < .05) and increase of switched memory and switched CD27(-) B-cells and germinal center founder cells were detected in PB of MM compared with controls (P < .01). Similar results were found in BM. β2 microglobulin level in MM positively correlated with the number of PCs and negatively with percentage of naive B-cells (P < .05). CONCLUSION: Our results provided a detailed phenotypic profile and enumeration of B and PC subpopulations in monoclonal gammopathy patients. A reduced number of B-cells and particularly a differentiation shift to more numerous antigen-stimulated forms was observed in MM. This might indicate a potential source of myeloma-initiating cells in one of these subpopulations.

• MeSH
• antigeny povrchové metabolismus   MeSH
• chromozomální aberace MeSH
• diferenciální diagnóza MeSH
• dospělí MeSH
• fenotyp MeSH
• imunofenotypizace MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mnohočetný myelom diagnóza   genetika   metabolismus   MeSH
• monoklonální gamapatie nejasného významu diagnóza   genetika   metabolismus   MeSH
• paraproteinemie diagnóza   genetika   metabolismus   MeSH
• podskupiny B-lymfocytů metabolismus   patologie   MeSH
• průtoková cytometrie MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Most consensus leukemia & lymphoma antibody panels consist of lists of markers based on expert opinions, but they have not been validated. Here we present the validated EuroFlow 8-color antibody panels for immunophenotyping of hematological malignancies. The single-tube screening panels and multi-tube classification panels fit into the EuroFlow diagnostic algorithm with entries defined by clinical and laboratory parameters. The panels were constructed in 2-7 sequential design-evaluation-redesign rounds, using novel Infinicyt software tools for multivariate data analysis. Two groups of markers are combined in each 8-color tube: (i) backbone markers to identify distinct cell populations in a sample, and (ii) markers for characterization of specific cell populations. In multi-tube panels, the backbone markers were optimally placed at the same fluorochrome position in every tube, to provide identical multidimensional localization of the target cell population(s). The characterization markers were positioned according to the diagnostic utility of the combined markers. Each proposed antibody combination was tested against reference databases of normal and malignant cells from healthy subjects and WHO-based disease entities, respectively. The EuroFlow studies resulted in validated and flexible 8-color antibody panels for multidimensional identification and characterization of normal and aberrant cells, optimally suited for immunophenotypic screening and classification of hematological malignancies.

• MeSH
• hematologické nádory diagnóza   imunologie   MeSH
• imunofenotypizace normy   MeSH
• leukocyty imunologie   patologie   MeSH
• lidé MeSH
• monoklonální protilátky diagnostické užití   MeSH
• nádorové biomarkery imunologie   MeSH
• prognóza MeSH
• průtoková cytometrie normy   MeSH
• studie případů a kontrol MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• srovnávací studie MeSH
• Geografické názvy
• Evropa MeSH

Cíl studie: Vytvoření stratifikačního modelu s cílem identifikace vysoce rizikových osob s MGUS, u kterých bude možno zvažovat včasnou léčebnou intervenci. Typ studie: Retrospektivní studie Název a sídlo pracoviště: Interní hematoonkologická klinika, FN Brno - PMDV, Brno Materiál a metody: Na souboru 314 osob s MGUS zařazených do Registru monoklonálních gamapatií (RMG) byla provedena pilotní statistická analýza. Byla využita základní klinická data se zaměřením na prognostické parametry stávající (typ monoklonálního proteinu - MIG, hladina MIG, poměr sérových volných lehkých řetězců – FLC ratio) i nové (přítomnost cytogenetických aberací, flowcytometrické stanovení množství klonálních plazmocytů a přítomnost imunoparézy). Výsledky: Vyšší zastoupení morfologicky identifikovaných plazmocytů a nález >95 % PC aberantního fenotypu CD19- CD56+/- se statisticky významně častěji pojí s transformací MGUS do MM (p<0,05). Také přítomnost jakékoliv imunoparézy či imunoparézy postihující oba nepostižené imunoglobuliny byla statisticky významně častěji detekována u transformací MGUS do MM (p=0,001). První analýza stávajících a nových prognostických faktorů u MGUS dosáhla senzitivity stratifikace cca 50 % během 2 let. Závěr: Byl potvrzen význam hodnocení PC pomocí morfologie a průtokové cytometrie a důležitou úlohu hraje také přítomnost imunoparézy. Stratifikační modely budou dále vylepšovány s cílem dosažení senzitivity 90 % v rámci 2 let a obdobná analýza bude provedena také u asymptomatických myelomů (aMM).

Objective: The creation of the stratification model and identification of high-risk individuals with MGUS, which should be considered to an early therapeutic intervention. Design: The retrospective study Settings: Department of Internal medicine - Hematooncology, University Hospital Brno Material and Methods: The pilot statistical analysis of 314 MGUS subjects from Registry of Monoclonal Gammopathies (RMG) was done. Basic clinical data were used together with existing (type of monoclonal protein - MIG, level of MIG, serum free light chain ratio – FLC ratio) and new prognostic parameters (presence of cytogenetic abnormalities, flow cytometry enumeration of clonal plasma cells and presence of immunoparesis). Results: Higher number of plasma cells according to the morphology and presence of >95 % PC with aberrant phenotype CD19-CD56+/- as well were more frequently associated with transformation of MGUS into MM (p<0.05). Also, the presence of any immunoparesis and/or immunoparesis affecting both uninvolved immunoglobulins was more frequently detected in transformed MGUS (p=0.001). The first analysis of existing and new prognostic factors in MGUS achieved sensitivity of the stratification about 50 % within 2 years. Conclusion: The significance of morphological and flow cytometry assessment of PCs was confirmed and presence of the immunoparesis plays an important role as well. Model of stratification will be further developed with the aim of achieving 90 % sensitivity within 2 years and a similar analysis will be performed also for asymptomatic multiple myeloma (aMM).

• MeSH
• chromozomální aberace MeSH
• financování organizované MeSH
• interpretace statistických dat MeSH
• lehké řetězce imunoglobulinů analýza   krev   MeSH
• lidé MeSH
• mnohočetný myelom dietoterapie   etiologie   MeSH
• monoklonální gamapatie nejasného významu MeSH
• prognóza MeSH
• průtoková cytometrie metody   využití   MeSH
• retrospektivní studie MeSH
• statistika jako téma MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH