Úvod: V České republice se stanovuje na začátku těhotenství RhD krevní skupina, cílem screeningu je diagnostikovat RhD negativní těhotné ženy, které mohou být ohroženy rozvojem RhD aloimunizace, to nastává pouze v případě, že plod je RhD pozitivní. V současné době se prevence RhD aloimunizace provádí bez ohledu na znalost RHD statutu plodu. Již na začátku těhotenství je možné stanovit RHD genotyp plodu neinvazivně z volné fetální DNA cirkulující v mateřské periferní krvi. Problematika screeningového vyšetření RHD genotypu plodu je celosvětově řešena. V některých evropských zemích je vyšetření již rutinně zavedeno, a přispívá tak k optimalizaci prenatální péče o RhD negativní těhotné, aplikace imunoglobulinu je cílená pouze u těhotenství s RhD pozitivním plodem. Cílem naší práce je zhodnotit klinickou a laboratorní efektivitu screeningu RHD genotypu plodu u RhD negativních žen metodou TaqMan Real-time PCR. Typ studie: Prospektivní kohortová studie. Název a sídlo pracoviště: Porodnicko-gynekologická klinika LF UP a FN Olomouc; Ústav lékařské genetiky LF UP a FN Olomouc; Transfuzní oddělení FN Olomouc; Ústav lékařské biofyziky LF UP Olomouc. Materiál a metodika: V letech 2011–2015 ve Fakultní nemocnici Olomouc bylo provedeno 337 vyšetření RHD genotypu plodu u těhotných žen v I. a II. trimestru a hodnoceno pomocí TaqMan Real-time PCR. Výsledek byl poté ověřen na RHD genotypu novorozence. Výsledky: Metodika vyšetření RHD genotypu plodu je přesná, spolehlivá a využitelná v klinické praxi. Senzitivita byla 97,8 %, specificita byla 98,7 %. Při hodnocení efektivity zavedení neinvazivního screeningu RHD genotypu plodu u RhD negativních žen je nutné současně hodnotit hledisko medicínské, organizační i ekonomické. Důslednější provádění prevence RhD aloimunizace ve skutečně indikovaných případech může vést ke snížení incidence RhD aloimunizace. Závěr: Z medicínského hlediska je stanovení RHD genotypu plodu u všech RhD negativních žen na začátku těhotenství jednoznačně efektivní. Umožní diagnostikovat přibližně 40 % RhD negativních plodů, kdy ženě není třeba podat IgG anti-D. Stanovení RHD genotypu plodu pomocí metodiky TaqMan Real-time PCR genotypu plodu je využitelné v klinické praxi.

Objective: In the Czech Republic in all women within a first trimester screening a laboratory testing for RhD blood group from the peripheral blood should be performed. The aim of the screening is to diagnose RhD negative pregnant women, who may be at risk of developing RhD alloimmunization if the fetus is RhD positive. Currently, the prevention of RhD alloimmunization is carried out regardless of the knowledge of RHD fetal status. Already at the beginning of pregnancy it is possible to determine the RHD genotype of the fetus non-invasively due to cell free fetal DNA circulating in maternal peripheral blood detection. The issue of screening examination of fetal RHD genotype is solved worldwide. In some European countries, the examination is routinely established and thus contributes to the optimization of prenatal care for RhD negative pregnant women, immunoglobulin administration is targeted only in pregnancies with RhD positive fetus. The aim of our study is to evaluate clinical and laboratory effectiveness of fetal RHD genotype screening in RhD negative women by TaqMan Real-time PCR method. Designe: Prospective cohort study. Setting: Obstetrics and Gynecology Clinic of the Faculty of Medicine University Palacky and the University Hospital Olomouc; Institute of Medical Genetics of the Faculty of Medicine UP and the University Hospital Olomouc; Transfusion Department of the University Hospital Olomouc; Institute of Biophysics of the Faculty of Medicine UP Olomouc. Material and methods: In 2011-2015 at the University Hospital Olomouc 337 examinations of RHD fetal genotype were performed in pregnant women in first and second trimester and evaluated by TaqMan Real-time PCR, followed by verification of the newborn RHD genotype. Results: Methodology of fetal RHD genotype examination is accurate, reliable and useful in clinical practice. The sensitivity was 97.8%. The specificity was 98.7%. When assessing the effectiveness of the introduction of non- -invasive fetal RHD genotype screening in RhD negative women, it is necessary to assess the medical, organizational and economic aspects. More consistent prevention of RhD alloimmunization in the cases actually indicated may reduce the incidence of RhD alloimmunization. Conclusion: From the medical point of view the RHD genotype determination in all RhD negative women at the beginning of pregnancy seems effective. It allows to diagnose about 40% of pregnancies with RhD negative fetuses that do not require administration of IgG anti-D. IgG anti-D should be administered only in indicated cases. Determination of fetal RHD genotype by using TaqMan Real-time PCR is useful in clinical practice.

• Klíčová slova
• RhD negativní žena, volná fetální DNA, prevence RhD aloimunizace, RHD genotyp plodu,
• MeSH
• genotyp MeSH
• hematologické komplikace těhotenství * diagnóza   MeSH
• lidé MeSH
• neinvazivní prenatální testování MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• prenatální diagnóza * metody   MeSH
• prospektivní studie MeSH
• Rho(D) imunoglobulin analýza   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Vtéto prospektivní studii shrnujeme naše zkušenosti se zavedenímnové neinvazivnímetody prenatálníRHD, RHC a RHE genotypizace plodu z periferní krve RhD negativních těhotných žen s využitím PCRv reálném čase a specifických primerů a TaqMan sond navržených pro RHD a RHCE geny. Celkem bylotestováno 29 RhD negativních těhotných žen v rozmezí 14. a 40. týdne gravidity.Výsledky neinvazivníprenatální RHD, RHC a RHE genotypizace plodu provedené na DNA extrahované z periferní krvematek jsme korelovali s výsledky imunohematologické analýzy pupečníkové krve po porodu dítěte.Výsledky genotypizace plodu v oblasti exonu 7 a exonu 10 RHD genu byly ve shodě s vyšetřenímpupečníku u 29 z 29 RhD negativních těhotných žen, které porodily 13 RhD pozitivních a 16 RhDnegativních dětí. RHC genotypizace plodu v oblasti exonu 2 byla správně provedena u 25 z 25 Rhchomozygotních těhotných žen, z toho 8 žen porodilo RhC pozitivní a 17 RhC negativní děti. RHEgenotypizace plodu byla rovněž správně provedena u 29 z 29 Rhe homozygotních těhotných žen, z toho5 žen porodilo RhE pozitivní a 24 RhE negativní děti. RHC a RHE genotypizace plodu je velmi cennázejména v případě identifikace RhD negativního plodu vzhledem k amplifikaci další paternálně zděděnéalely, jež je průkazem přítomnosti fetálníDNAvmateřské cirkulaci.Doporučujeme proto provádětsimultánní RHD, RHC a RHE genotypizaci plodu u RhD negativních aloimunizovaných těhotenství veII. nebo III. trimestru gravidity za předpokladu, že matka nese příslušný Rh fenotyp (ccee, ccEe, Ccee).

In this prospective study,we assessed the feasibility of foetalRHD,RHCandRHEgenotyping by analysisof DNA extracted from maternal plasma samples collected from RhD negative pregnant women usingRQ-PCR and primers and probes targeted toward RHD and RHCE genes.We analysed 29 RhD negativepregnant women within 14th and 40th week of pregnancy and correlated the results with serologicalanalysis of cord blood after the delivery. Non-invasive prenatal foetal RHD exon 7 and exon 10genotyping analysis of maternal plasma samples was in complete concordance with the analysis of cordblood in 29 out of 29 RhD negative pregnant women delivering 13 RhD positive and 16 RhD negativenewborns. Non-invasive prenatal foetal RHC exon 2 genotyping was well performed in 25 out of 25 Rhchomozygote pregnant women delivering 8 RhC positive and 17 RhC negative newborns. Similarlynon-invasive prenatal foetal RHE genotyping was well done in 29 out of 29 Rhe homozygote pregnantwomen delivering 5 RhE positive and 24 RhE negative newborns. Foetal RHC and RHE genotyping inRhD negative pregnancies is very valuable, since in case of identification of RhD negative fetussimultaneous amplification of another paternally inherited allele (RhC or RhE positivity) proves thepresence of foetal DNA in maternal circulation. We recommend to perform simultaneous foetal RHD,RHC and RHE genotyping in alloimunised RhD negative pregnancies with certain phenotypes (ccee,ccEe, Ccee).

• MeSH
• dospělí MeSH
• fenotyp MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• genotyp MeSH
• hematologické komplikace těhotenství diagnóza   terapie   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci plodu diagnóza   genetika   MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• prenatální diagnóza metody   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin genetika   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

V této prospektivní studii shrnujeme naše zkušenosti se zavedením nové neinvazivní metody prenatálnídiagnostiky RHD genotypizace plodu z periferní krve těhotných žen s využitím PCR v reálném časea specifických primerů a TaqMan sond pro exon 7 a exon 10 RHD genu. Celkem jsme analyzovali 46vzorků od 39 RhD negativních těhotných žen (z toho 5 aloimunizovaných: 1x anti-D, 2x anti-D a anti-Ca 2x přítomnost nespecifických protilátek v enzymatickém testu). Výsledky neinvazivní prenatálníRHD genotypizace plodu provedené na DNA extrahované z periferní krve matek jsme korelovalis výsledky imunohematologické analýzy pupečníkové krve po porodu dítěte. Výsledky genotypizaceplodu v oblasti exonu 7 RHD genu byly ve shodě s vyšetřením pupečníku u všech těhotných žen, kterédoposud porodily (n = 20, z toho 12 RhD pozitivních a 8 RhD negativních dětí). V případě genotypizaceplodu v oblasti exonu 10 RHD genu jsme nedetekovali RhD pozitivitu plodu u 10 z 12 těhotenství.Předpokládáme, že tyto dva falešně negativní výsledky mohly být způsobeny částečnou delecí neboaberacemi RHD genu v 3´ netranslatované oblasti exonu 10, kde se specifické primery a TaqMan sondaváží k cílové DNA. Specificita metody pro oba RHD (exon 7 a exon 10) RQ-PCR systémy dosáhla 100 %,jelikož jsme v periferní krvi těhotných žen, které porodilyRhDnegativní děti (n = 8),nedetekovali žádnéRHD pozitivní amplifikační signály. Neinvazivní predikce RhD statutu plodu je rychlá a spolehliváa může být zahrnuta do rutinních vyšetření prenatální diagnostiky. Pro spolehlivou diagnostiku všakdoporučujeme, aby byla vždy prováděna amplifikace alespoň dvou různých oblastí RHD genu. NeinvazivníprenatálníRHD genotypizace plodu umožňuje identifikaci plodů v riziku hemolytického onemocnění.Doporučujeme, aby byl v průběhu těhotenství u každé RhD negativní ženy vyšetřen neinvazivněRHD genotyp plodu, nejlépe v I. nebo II. trimestru, a to i u nesenzibilizovaných těhotenství, kterých jevětšina.

In this prospective study, we assessed the feasibility of fetal RHD genotyping by analysis of DNAextracted from maternal plasma samples collected from RhD negative pregnant women using RQ-PCRand primers and probes targeted toward exon 7 and exon 10 of RHD gene.We analysed 46 samples from39 RhD negative pregnant women including 5 sensitised (1x anti-D, 2x anti-D and anti-C, 2x non-specificantibodies in enzymatic assay) and correlated the results with serological analysis of cord blood afterthe delivery. Non-invasive prenatal fetal RHD exon 7 genotyping analysis of maternal plasma sampleswas in complete concordance with the analysis of cord blood in all 20 RhD negative pregnant womendelivering 12RhDpositive and8RhDnegativenewbornsuntilnow.RHDexon 10 specificPCRampliconswere not detected in 2 out of 12 studied plasma samples from women bearing RhDpositive fetus, despitethe positive amplification in RHD exon 7 region observed in all cases. We supposed that false negativeresults might be caused by a partly deletion or aberrant structure of the 3´ untranslated exon 10 regionof RHD gene where specific primers and probe should anneal. The specificity of both RHD exon 7 andexon 10 systems approached 100% since no RHD positive signals were detected in women currentlypregnant with RhD negative fetus (n = 8). Prediction of fetal Rhesus D status from maternal plasma ishighly accurate and enables implementation into clinical routine. We suggest that safe non-invasiveprenatal fetal RHD genotyping using maternal plasma should involve the amplification of at least twoRHD specific products. Fetal RHD genotyping may allow the identification of fetuses at risk ofhaemolytic disease of newborn. However,we suggest to apply a non-invasive prenatal RHD genotyping assay in the routine testing of allRhDnegativewomen involving both sensitised as well as nonsensitizedpregnancies, which is the majority.

• MeSH
• DNA krev   MeSH
• dospělí MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• genotyp metody   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci plodu diagnóza   genetika   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• prospektivní studie MeSH
• Rho(D) imunoglobulin genetika   krev   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

Cíl studie: Zjistit incidenci spontánní antepartální RhD aloimunizace u RhD negativních těhotných žen s RhD pozitivním plodem. Typ studie: Původní práce. Název a sídlo pracoviště: Porodnicko-gynekologická klinika FN Olomouc. Metodika: Celkem bylo vyšetřeno 906 RhD negativních žen s RhD pozitivním plodem a bez přítomnosti aloprotilátek anti-D na začátku těhotenství. Vždy se jednalo o jednočetné těhotenství, RhD krevní skupina ženy byla stanovena v I. trimestru těhotenství, RhD skupina plodu byla určena po porodu. Screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek byl všem ženám proveden v I. trimestru těhotenství, ve 28.–32. týdnu těhotenství a bezprostředně před porodem ve 38.–42. týdnu. Pokud byly u těhotné ženy před porodem diagnostikovány aloprotilátky anti-D, byl vždy proveden screening protilátek i následně za šest měsíců po porodu. Screening protilátek byl proveden v nepřímém antiglobulinovém (LISS/NAT) a enzymovém (papain) testu s jejich následnou identifikací pomocí panelu typových erytrocytů metodou sloupcové aglutinace Dia-Med. Po porodu byl u všech RhD negativních žen stanoven objem fetomaternální hemoragie a byla provedena prevence RhD aloimunizace podáním potřebné dávky IgG anti-D, antepartálně nebyl IgG anti-D žádné ženě podán. Výsledky: Při kontrolním screeningu nepravidelných antierytrocytárních protilátek ve 28.–32. týdnu těhotenství byly aloprotilátky anti-D diagnostikovány u 0,2 % žen (2/906), bezprostředně před porodem ve 38.–42. týdnu těhotenství byly diagnostikovány aloprotilátky anti-D u 2,3 % žen (21/906) a opakovaně i za šest měsíců po porodu (21/157). U 82,7 % žen (749/906) však nebylo vyšetření za šest měsíců po porodu provedeno, a nelze u nich tudíž spolehlivě vyloučit spontánní antepartální RhD aloimunizaci, která nemusela být v termínu porodu ještě diagnostikovatelná. Při nepřítomnosti aloprotilátek anti-D před porodem byl všem ženám po porodu podán IgG anti-D v dávce minimálně 125 μg intramuskulárně. Závěr: U RhD negativních žen s RhD pozitivním plodem byla incidence spontánní antepartální RhD aloimunizace minimálně 2,3 %. Většině případů lze teoreticky zabránit preventivním podáním IgG anti-D v dávce 250 μg intramuskulárně všem RhD negativním ženám ve 28. týdnu těhotenství.

Aim of the study: Assess the incidence of spontaneous antepartal RhD alloimmunization in RhD negative pregnant women with an RhD positive fetus. Design: Clinical study. Setting: Department of Obstetrics and Gynecology, Medical School and University Hospital Olomouc. Methods: A total of 906 RhD negative women with an RhD positive fetus and without the presence of anti-Dalloantibodies at the beginning of pregnancy were examined. Always it was a singleton pregnancy, RhD blood group of the pregnant women was assessed in the 1st trimester of pregnancy, RhD status of the fetus was determined after delivery. Screening for irregular antierythrocyte antibodies was performed in all women in the 1st trimester of pregnancy, at 28–32 weeks gestation and immediately prior to delivery at 38–42 weeks gestation. Screening for irregular antierythrocyte antibodies was performed also at 6 months following delivery in all cases of positive antibodies before delivery. Antibody screening was performed using the indirect antiglobulin (LISS/NAT) and enzyme (papain) test with their subsequent identification using a panel of reference erythrocytes by column agglutination method Dia-Med. After delivery, the volume of fetomaternal hemorrhage was assesed in all RhD negative women and RhD alloimmunization prophylaxis was performed by administering the necessary IgG anti-D dose; none of the women were administered IgG anti-D antepartally. Results: During screening for irregular antierythrocyte antibodies at 28–32 weeks gestation, anti-D alloantibodies were diagnosed in 0.2% of the women (2/906); immediately prior to the delivery at 38-42 weeks gestation, anti-D alloantibodies were diagnosed in 2.3% of the women (21/906) and repeatedly even at 6 months following delivery (21/157). In 82.7% of the women (749/906), examination at 6 months following delivery was not performed, therefore in these women spontaneous antepartal RhD alloimmunization cannot reliably be ruled out. Alloimmunization may not be diagnosed yet at term of delivery. If anti-D alloantibodies were not present prior to the delivery, these women were all administered IgG anti-D in a dose of at least 125 μg after delivery. Conclusion: In RhD negative women with an RhD positive fetus, the incidence of spontaneous antepartal RhD alloimmunization was at least 2.3%. Most cases may theoretically be prevented by prophylactic administration of 250 μg of IgG anti-D to all RhD negative women at 28 weeks gestation.

• MeSH
• aglutinační testy MeSH
• fetomaternální transfuze MeSH
• hematologické komplikace těhotenství prevence a kontrola   MeSH
• incidence MeSH
• komplikace těhotenství MeSH
• lidé MeSH
• plod imunologie   MeSH
• plošný screening MeSH
• první trimestr těhotenství MeSH
• reakce antigenu s protilátkou MeSH
• Rh izoimunizace * diagnóza   prevence a kontrola   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin terapeutické užití   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Hemolytické onemocnění novorozence je závažnou příčinou fetální a neonatální mortality a morbidity. Nejvyšší riziko imunizace těhotné ženy nastává v souvislosti s porodem a/nebo nitroděložními zákroky během těhotenství. Imunizaci lze ve velké většině případů u RhD negativních matek zabránit včasným podáním anti-D imunoglobulinu. Pokud došlo u ženy k imunizaci, nelze jí v současnosti dostupnými metodami vyléčit, a imunizace svým trvalým charakterem může ženě zabránit v reprodukci. Toto doporučení formalizuje způsob a dávky podávání anti-D imunoglobulinu v těhotenství

Hemolytic disease of the newborn causes severe fetal and neonatal mortality and morbidity. Highest risk of alloimmunization is in connection with delivery/labour and/or intrauterine invasive procedures during pregnancy. Alloimmunization of Rh-D negative mothers can be prevented in most cases with administration of anti-D imunoglobulin. Today we have no effective treatment for women where alloimmunization has already developed. Alloimmunization can prevent the women from further reproduction. This paper presents guidelines for anti-D administration in pregnancy.

• MeSH
• hematologické komplikace těhotenství MeSH
• lidé MeSH
• plošný screening MeSH
• Rh izoimunizace krev   prevence a kontrola   terapie   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin aplikace a dávkování   terapeutické užití   MeSH
• sekundární prevence MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• směrnice pro lékařskou praxi MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

I přes zavedení anti-D profylaxe do klinické praxe představuje RhD aloimunizace problém i v současnosti. Skutečná incidence RhD aloimunizace u těhotných žen není ve většině zemí známa. Anti-D imunoglobulin je podáván RhD negativním ženám paušálně a v mnohem větších dávkách, než je skutečně potřeba. Na druhou stranu však není možné diagnostikovat případy, kdy je nutné podat dávku větší. Pro optimální provádění prevence RhD aloimunizace u RhD negativních žen je důležité diagnostikovat stavy, kdy dochází k fetomaternální hemoragii (FMH), přesně určit její objem, a následně podat potřebnou dávku anti-D imunoglobulinu. Možnost spolehlivě detekovat FMH a přesně určit její objem by umožnila provádět prevenci RhD aloimunizace lépe a levněji. Anti-D imunoglobulin by bylo možné podávat jen ve skutečně indikovaných případech a jen v dávce nezbytně nutné pro prevenci RhD aloimunizace. Práce vychází ze závěrů Evidence Based Medicine a z doporučených postupů. Vzhledem k medicínskému významu a nezanedbatelným ekonomickým nákladům spojeným s prováděním prevence RhD aloimunizace by bylo vhodné stanovit přesné metodické postupy. Vlastní text by se měl omezit na seznam potenciálně senzibilizujících událostí, při kterých by měl být RhD negativním ženám podán anti-D imunoglobulin, nejsou-li u nich již přítomny aloprotilátky anti-D. U každé potenciálně senzibilizující události by měla být definována minimální dávka anti-D imunoglobulinu potřebná k prevenci RhD aloimunizace. Po 20. týdnu těhotenství by současně měl být stanoven objem FMH k upřesnění potřebné dávky anti-D imunoglobulinu.

Despite the introduction of anti-D prophylaxis into clinical practice, RhD alloimmunization still presents a problem to date. The actual incidence of RhD alloimmunization in pregnant women remains unknown in most countries. Anti-D immunoglobulin is administered to RhD negative women at a fixed dose and in much greater amounts than is actually necessary. On the other hand, it is not possible to diagnose cases where greater doses are needed. To optimize the prevention of RhD alloimmunization in RhD negative women, it is important to diagnose conditions that lead to fetomaternal hemorrhage (FMH), precisely determine the volume and subsequently administer the appropriate dose of anti-D immunoglobulin. The possibility to accurately detect FMH and precisely determine its volume would enable more effective and less costly prevention of RhD alloimmunization. Anti-D immunoglobulin could be administered only in indicated cases and only in doses essentially necessary for prevention of RhD alloimmunization. This article is based on the conclusions of evidence-based medicine and a review of guidelines. Due to the medical significance and indispensable economic costs associated with prevention of RhD alloimmunization, it would be appropriate to establish exact methodical guidelines. The text itself should be limited to a list of potentially sensitising events during which anti-D immunoglobulin should be administered to RhD negative women if anti-D antibodies are not already present. Following each potentially sensitising event, the minimal dose of anti-D immunoglobulin necessary for prevention of RhD alloimmunization should be determined. After 20 weeks of gestation, the volume of FMH should also be determined to specify the necessary dose of anti-D immunoglobulin.

• MeSH
• fetomaternální transfuze diagnóza   farmakoterapie   prevence a kontrola   MeSH
• financování organizované MeSH
• lidé MeSH
• medicína založená na důkazech MeSH
• Rh izoimunizace prevence a kontrola   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin aplikace a dávkování   MeSH
• směrnice pro lékařskou praxi jako téma MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Cíl studie: Vytvoření a zavedení metodického postupu pro neinvazivní stanovení RHD genotypu plodu z volné fetální DNA cirkulující v periferní krvi těhotné ženy do klinické praxe. Posouzení citlivosti inovované metodiky pomocí ředící řady a vnitřní kontroly amplifikace. Zjištění detekčního limitu minoritního zastoupení RHD+/- genotypu ve vzorku RHD-/-. Typ studie: Prospektivní kohortová a metodologická studie. Název a sídlo pracoviště: Fakultní nemocnice Olomouc: Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny, Porodnicko-gynekologická klinika, transfuzní oddělení. Metodika: TaqMan real-time PCR bez vnitřní kontroly amplifikace. Stanovení prahu citlivosti a kalibrace RHD multiplexu TaqMan real-time PCR multiplexem s vnitřní kontrolou amplifikace a kapilární elektroforézou – minisekvenací (SNaPshot – multiplex) s vnitřní kontrolou amplifikace. Výsledky: RHD pozitivní nebo RHD negativní plod byl určen na základě amplifikačních křivek z real-time PCR systému, které odpovídají stanoveným parametrům pro hodnocení výstupních dat s využitím série kontrol amplifikace a kontaminace. Metody TaqMan real-time PCR systém a minisekvenace byly schopny detekovat 0,22% zastoupení RHD+/- ve vzorku RHD-/-. Minisekvenační systém je vhodný k rozlišení RHD pozitivních homozygotů a heterozygotů. Závěr: V současné době námi zavedený postup založený na detekci exonu 7 genu RHD a sérii paralelních kontrol kontaminace a amplifikace je využívaný v klinické praxi. Obě nově vypracované metody by měly být spolehlivější a po validaci na rozsáhlejším souboru mohou být zavedeny do klinické praxe.

Objective: Introduction of fetal RHD genotyping from cell-free fetal DNA circulating in the peripheral blood of pregnant women to clinical practice. Sensitivity assessment of innovated method using range of dilution series and internal control of amplification. Design: Procedure creating of noninvasive determination of fetal RHD genotyping from blood plasma of pregnant women. Detection of limit of minority representation RHD+/- sample in the RHD-/- sample. Setting: University Hospital Olomouc, Institute of Medical Genetics and Fetal Medicine, Clinic of Obstetrics and Gynecology, Transfusion Department. Methods: TaqMan Real-Time PCR without an internal amplification controls. Optimization and calibration of RHD genotyping using RHD multiplex by TaqMan Real-Time PCR with an internal amplification control and by minisequencing (Snapshot – multiplex) with an internal amplification controls. Results: RHD positive or negative fetuses were determined by amplification curves from Real-Time PCR system that matches the parameters for the evaluation of the output data using series of amplification and contamination parallel controls. TaqMan based Real-Time PCR and minisequencing (SNaPshot) based quantification were able to detect 0.22% of artificial RHD+/- sample diluted in RHD-/- sample. In addition, SNaPshot assay is suitable for heterozygozity and homozygozity recognition. Conclusion: Current established and routinely used procedure is based on the detection of exon 7 of the RHD gene and on the series of parallel amplification and contamination controls. Both newly developed methods could be, after validation of the larger set of control samples, introduced into clinical practice.

• Klíčová slova
• RHD genotypizace, volná fetální DNA, TaqMan real-time PCR, SNaPshot – minisekvenace, minisekvenace, RHD genotypizace – volná fetální DNA – maternální plazma – TaqMan real-time PCR – SNaPshot – minisekvenace, RHD genotyping, cell-free fetal DNA, maternal plasma, minisequencing,
• MeSH
• amplifikace genu genetika   MeSH
• DNA analýza   genetika   krev   MeSH
• elektroforéza kapilární MeSH
• exony genetika   MeSH
• genotyp * MeSH
• kohortové studie MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce * metody   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci plodu diagnóza   MeSH
• plod * MeSH
• polymerázová řetězová reakce * metody   MeSH
• prenatální diagnóza metody   MeSH
• prospektivní studie MeSH
• Rho(D) imunoglobulin * genetika   krev   MeSH
• sekvenční analýza DNA MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví * MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

The aim of the project is implementation of a method for determining fetal RHD and KELL genotype from free fetal DNA circulating in the peripheral blood of pregnant women. The examination must be precise, reliable and accessible, so as to be routinely used in clinical practice. To date, no real validation of such method which could lead to implementation into clinical practice has been performed on a representative group of pregnant and positive and negative controls in the Czech Republic.

Cílem projektu je zavedení metodiky pro stanovení RHD a KELL genotypu plodu z volné fetální DNA cirkulující v periferní krvi těhotné ženy. Vyšetření musí být přesné, spolehlivé a dostupné, tak aby bylo rutinně využitelné v klinické praxi. Dosud nebyla v České republice provedena skutečná validace metodiky na reprezentativním souboru vzorků těhotných a pozitivních i negativních kontrol, ze které by se mohlo vycházet při zavádění této metodiky do klinické praxe.

• MeSH
• fetální krev MeSH
• genotyp MeSH
• genotypizační techniky MeSH
• hematologické komplikace těhotenství MeSH
• hemolytická nemoc plodu a novorozence genetika   prevence a kontrola   MeSH
• krevní skupiny - systém Kell MeSH
• krevní skupiny - systém Rh-Hr MeSH
• onemocnění periferních cév MeSH
• prenatální diagnóza MeSH
• Rh izoimunizace MeSH
• Rho(D) imunoglobulin aplikace a dávkování   terapeutické užití   MeSH
• těhotné ženy MeSH
• ženy MeSH

• Konspekt
• Gynekologie. Porodnictví
• NLK Obory
• gynekologie a porodnictví
• perinatologie a neonatologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

Fetomaternální hemoragie (FMH) je stav, kdy dochází k průniku krve plodu do mateřské cirkulace, nejčastěji při porodu. FMH může být příčinou erytrocytární aloimunizace matky. RhD negativním ženám je proto po porodu RhD pozitivního plodu preventivně aplikován anti-D imunoglobulin. V současnosti je však podáván paušálně a v mnohem větších dávkách, než je skutečně potřeba. Naopak přibližně u 1 % porodů dochází k excesivní fetomaternální hemoragii, kdy je nutné podat dávku větší. Možnost spolehlivě detekovat FMH a přesně určit její objem umožní provádět prevenci RhD aloimunizace lépe a levněji. Anti-D imunoglobulin by bylo možné podávat jen ve skutečně indikovaných případech a jen v dávce nezbytně nutné pro prevenci RhD aloimunizace. Přesnou kvantifikaci objemu FMH poskytuje analýza průtokovou cytometrií, jako metodu screeningovou lze použít Kleihauerův-Betkeho test.

Fetomaternal haemorrhage (FMH) is a status characterised by penetration of fetal blood into the maternal circulation which happens mostly at delivery. FMH may cause erythrocytal alloimmunisation of woman. That is why anti-D immunoglobulin (IgG anti-D) is being administered to RhD negative women after delivery of RhD positive fetus. IgG anti-D is administered to RhD negative women standardly and in much greater quantities than is actually necessary. However, on the other hand, it is not possible to diagnose cases where a greater dose is required. To optimalise prevention of RhD alloimmunization in RhD negative women, it is important to diagnose conditions where fetomaternal haemorrhage (FMH) occurs, precisely define its volume and consequently administer the required dose of IgG anti-D. The ability to reliably detect fetomaternal haemorrhage (FMH) and precisely define its volume would allow better and less expensive prevention of RhD alloimmunization in RhD negative women. IgG anti-D could thus be administered only in cases that are actually indicated and only in doses necessary for preventing RhD alloimmunization. Accurate quantification of FMH is determined by flow cytometry.

• Klíčová slova
• Kleihauerův-Betkeho test, anti-D imunoglobulin, RhD aloimunizace,
• MeSH
• Coombsův test MeSH
• fetomaternální transfuze diagnóza   MeSH
• isoprotilátky analýza   MeSH
• krevní skupiny - systém Rh-Hr MeSH
• lidé MeSH
• průtoková cytometrie MeSH
• Rh izoimunizace diagnóza   MeSH
• těhotenství MeSH
• tvorba rozet MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Osoby s pozitivním Rh faktorem jsou více chráněny vůči patogenním vlivům zevního prostředí včetně poruch navozených latentní infekcí Toxoplasma gondii, stárnutím a patrně i únavou. Studie se zaměřila na podíl Rh faktoru na modifikaci klinického obrazu schizofrenie. V populaci 186 schizofrenních pacientů, účastníků denního stacionáře, jsme zjištiovali, zda RhD fenotyp ovlivňuje klinický obraz onemocnění u pacientu se schizofrenií vyšetřených na sérologickou přítomnost toxoplazmové infekce. Zjistili jsme, že RhD fenotyp vykazoval signifikantní vliv na obraz onemocnění u schizofrenních pacientů, zejména u žen. RhD-negativní ženy vykazovaly více pozitivních příznaků schizofrenie a větší míru zkreslení reality v PANSS škále než RhD-pozitivní ženy. U mužů ovlivňoval RhD fenotyp průběh onemocnění podstatně méně a obvykle opač¬ ným způsobem než u žen. Délka hospitalizace v počtu dní byla signifikantně delší u RhD-negativních žen oproti RhD-pozitivním ženám a byly jim ordinovány i vyšší dávky antipsychotik. Efekt RhD fenotypu na průběh schizofrenie nesouvisel s obdobným, již dříve popsaným efektem toxoplasmózy, tj. uplatňoval se jak u infikovaných, tak neinfikovaných pacientů. RhD-pozitivní fenotyp můžeme považovat za nadějný protektivní faktor zmírňující klinické projevy schizofrenie.

Rh-positive factor subjects are better protected against pathogenic environmental factors including impairment associated with latent infec- tion of Toxoplasma gondii , aging and possibly also tiredness. Our study was focused on contribution of Rh factor to schizophrenia clinical picture modification. In the population of 186 schizophrenia patients who attended day-treatment structured programme we investigated w hether RhD phenotype has any clinical impact on clinical manifestation of schizophrenia patients who were tested for seropositivity to Toxoplasma infection. We found out that RhD phenotype was linked with significant impact on clinical presentation in schizophrenia patients es pecially in women. RhD-negative women showed more severe positive symptoms of schizophrenia and more pronounced reality distorsion dimension in PANSS scale in comparison to RhD-positive women. The course of the illness was substantially less influenced by RhD phenotype in men. Length of hospi- tal stay measured by number of days was significantly incr eased in RhD-negative women and they we re prescribed also high er dose s of anti-psychotics. The effect of RhD phenotype was independent on similar, already described, effect of toxoplasma infection, as it was o bserved both in Toxoplasma -infected and Toxoplasma -free patients. RhD-positive phenotype can be considered as a promising protective factor moderating cli- nical picture of schizophrenia.

• Klíčová slova
• protektivní faktory, latentní toxoplazmóza,
• MeSH
• antipsychotika terapeutické užití   MeSH
• délka pobytu MeSH
• dospělí MeSH
• fenotyp MeSH
• financování organizované MeSH
• kohortové studie MeSH
• krevní skupiny - systém Rh-Hr genetika   imunologie   krev   MeSH
• latence viru MeSH
• lidé MeSH
• pacienti hospitalizovaní statistika a číselné údaje   MeSH
• psychiatrické posuzovací škály MeSH
• schizofrenie krev   parazitologie   MeSH
• sexuální faktory MeSH
• statistika jako téma MeSH
• toxoplazmóza diagnóza   imunologie   parazitologie   MeSH
• věk při počátku nemoci MeSH
• vztah mezi dávkou a účinkem léčiva MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• ženské pohlaví MeSH