Chronická myeloidní leukémie (CML) je charakterizována přítomností hybridního genu BCR-ABL, který vzniká v důsledku reciproké translokace t(9;22)(q34;q11) karyotypicky detekovatelné jako Ph chromozóm. Gen BCR-ABL kóduje hybridní protein s konstitutivně zvýšenou tyrozinkinázovou aktivitou, o kterém bylo prokázáno, že hraje zásadní roli v patogenezi onemocnění. Gen BCR-ABL je typickým znakem CML sloužícím k upřesnění diagnózy a sledování úspěšnosti léčby. Nejcitlivější metodou pro zjištění přítomnosti této aberace je reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) detekující transkript BCR-ABL, se schopností zjistit 1 leukemickou buňku mezi 105–106 normálních leukocytů. Pro sledování změn v hladině transkriptů BCR-ABL je využívána kvantitativní RT-PCR (Q-RT-PCR), která má vysoký prognostický význam. Nárůst a vysoká hladina transkriptu BCR-ABL jednoznačně signalizují špatnou odpověď na léčbu a špatnou prognózu, naproti tomu pokles a nízká hladina BCR-ABL dobrou odpověď na léčbu a dobrou prognózu. Pomocí Q-RT-PCR je možno zjistit změny stavu onemocnění o několik týdnů i měsíců dříve než ostatními metodami. V ÚHKT v Praze byla Q-RT-PCR zavedena v roce 1994 pro potřebu časného zjištění relapsu u pacientů po transplantaci kmenových buněk (TKB) a nyní je využívána pro monitorování úspěšnosti léčby všech pacientů s CML. Potvrdili jsme, že tato citlivá, přesná a neinvazivní vyšetřovací metoda má pro sledování stavu pacientů s CML zásadní význam.

Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by the presence of BCR-ABL fusion gene resulting from the reciprocal chromosome translocation t(9;22)(q34;q11), karyotypically detected as Ph chromosome. BCR-ABL gene was proved to play the principal role in CML pathogenesis. It is a hallmark of CML used in diagnostics and monitoring of the response to the therapy. The most sensitive method of detecting BCR-ABL aberration is RT-PCR which is able to find a single in leukemic cell betweey 106 normal leukocytes. Monitoring of BCR-ABL transcript level by quantitative RT-PCR is of the high prognostic value. High or increasing BCR-ABL transcript number signalizes bad response to treatment and a bad prognosis. On the contrary RT-PCR negativity, low level, or decreasing BCR-ABL transcript number denotes good response to treatment and good prognosis. Q-RT-PCR can detect changes in disease status several weeks or even months earlier than other methods. In 1994 the Q-RT-PCR was introduced at the Institute of Hematology and Blood Transfusion in Prague and was used for early detection of relapse after transplantation. At present it is used in all patients with CML for monitoring of response to the treatment. We have confirmed that this precise, sensitive and non-invasive method is of the principal importance for monitoring of disease status in CML patients.

• MeSH
• bcr-abl fúzové proteiny farmakokinetika   genetika   krev   MeSH
• chronická myeloidní leukemie diagnóza   genetika   terapie   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• lidé MeSH
• methansulfonáty aplikace a dávkování   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí ekonomika   metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• přehledová literatura jako téma MeSH
• prognóza MeSH
• transplantace kmenových buněk MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

Although it is generally accepted that signal transduction in plant mitogen-activated protein kinase signaling cascades is regulated via rapid posttranslational modifications, there are also several compelling examples of swift stress induced transcriptional activation of plant MAP kinase genes. A possible function of these fast and transient events is to compensate for protein losses caused by degradation of phosphorylated MAP kinases within stimulated pathways. Nevertheless, there is still need for additional evidence to precisely describe the regulatory role of plant MAP kinase transcriptional dynamics, especially in the context of whole stress stimulated pathways including also other signaling molecules and transcription factors. During the last two decades a reverse transcription quantitative real-time PCR became a golden choice for the accurate and fast quantification of the gene expression and gene expression dynamic. In here, we provide a robust, cost-effective SYBR Green-based RT-qPCR protocol that is suitable for the quantification of stress induced plant MAP kinase transcriptional dynamics in various plant species.

• MeSH
• Arabidopsis účinky léků   genetika   růst a vývoj   fyziologie   MeSH
• chlorid sodný farmakologie   MeSH
• DNA primery genetika   MeSH
• fyziologický stres genetika   MeSH
• klonování DNA MeSH
• komplementární DNA biosyntéza   genetika   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• mitogenem aktivované proteinkinasy genetika   MeSH
• osmotický tlak účinky léků   MeSH
• regulace genové exprese u rostlin * účinky léků   MeSH
• reverzní transkripce * účinky léků   MeSH
• RNA rostlin genetika   izolace a purifikace   MeSH
• semenáček růst a vývoj   MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Accurate gene expression measurements are essential in studies of both crop and wild plants. Reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR) has become a preferred tool for gene expression estimation. A selection of suitable reference genes for the normalization of transcript levels is an essential prerequisite of accurate RT-qPCR results. We evaluated the expression stability of eight candidate reference genes across roots, leaves, flower buds and pollen of Silene vulgaris (bladder campion), a model plant for the study of gynodioecy. As random priming of cDNA is recommended for the study of organellar transcripts and poly(A) selection is indicated for nuclear transcripts, we estimated gene expression with both random-primed and oligo(dT)-primed cDNA. Accordingly, we determined reference genes that perform well with oligo(dT)- and random-primed cDNA, making it possible to estimate levels of nucleus-derived transcripts in the same cDNA samples as used for organellar transcripts, a key benefit in studies of cyto-nuclear interactions. Gene expression variance was estimated by RefFinder, which integrates four different analytical tools. The SvACT and SvGAPDH genes were the most stable candidates across various organs of S. vulgaris, regardless of whether pollen was included or not.

• MeSH
• komplementární DNA genetika   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   MeSH
• rostlinné geny * MeSH
• sekvenční analýza RNA MeSH
• Silene genetika   MeSH
• stanovení celkové genové exprese MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• validační studie MeSH

Východisko. Molekulárně biologické metody založené na reverzní transkripci a následné polymerázové řetězové reakci (RT-PCR) jsou schopny detekovat přítomnost transkriptu BCR-ABL u chronické myeloidní leukémie (CML). V tomto sdělení prezentujeme naše zkušenosti se sledováním reziduální leukémie metodou real-time PCR s detekcí hybridizačními sondami u nemocných s CML léčených imatinibem a při sběru periferních krvetvorných buněk (PKB). Metody a výsledky. Stanovení hladin transkriptu BCR-ABL v periferní krvi bylo provedeno u 27 osob před nasazením a v průběhu léčby imatinibem mesylátem. Medián relativního množství BCR-ABL v periferní krvi před nasazením imatinibu byl 2,55 %. Množství transkriptu u 23 osob bez rezistence vůči imatinibu pokleslo během prvních šesti měsíců léčby na hodnotu 0,02 %. Po dvanáctiměsíční léčbě poklesl medián množství transkriptu na 0,005 %. V dalším průběhu léčby hladiny BCR-ABL kolísaly mezi hodnotami pod detekčním limitem metody (0,001 %) a 0,005 %. Tři pacienti byli vůči imatinibu primárně rezistentní s rozsahem hodnot od 0,13 % do 11,7 %. Jeden pacient vykazoval po 18 měsících léčby známky molekulárního relapsu. Z 16 pacientů po stimulaci PKB filgrastimem měly pouze dvě vyšetřované osoby hodnoty BCR-ABL v periferní krvi i v PKB pod detekčním limitem použité metody. U ostatních osob se koncentrace fúzního transkriptu pohybovala v koncentracích spolehlivě stanovitelných metodou RT-PCR. Závěry. Vzhledem k svému prognostickému významu je vyšetření BCR-ABL vhodné pro monitorování kinetiky reziduální choroby. Stanovení provedené v koncentrátu PKB jako potenciálním autotransplantátu může kompletovat informace o kvalitě těchto buněk z hlediska proporce BCR-ABL transkriptu a nastínit další možné terapeutické postupy a prognózu pacienta.

Background. Molecular biology methods based on reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) are able to detect the presence of BCR-ABL transcripts in chronic myeloid leukemia (CML). In this study we present our experience with monitoring of residual disease using real-time PCR with hybridization probes detection in patients treated with imatinib mesylate and in collected peripheral blood progenitor cells (PBPC). Methods and Results.We measured the level of BCR-ABL transcripts in peripheral blood cells of 27 subjects before and in the course of the imatinib treatment. The median of relative quantity of BCR-ABL in the blood before imatinib therapy was 2.55%. The number of the transcripts in 23 imatinib-sensitive subjects decreased to 0.02% in 6 months. After 12 months of the treatment the BCR-ABL median was 0.005%. Subsequent levels fluctuated between values below the detection limit (DL, 0.001%) and 0.005%. Three patients were primarily resistant to imatinib with the BCR-ABL range of 0.13%-11,7% during the treatment. One subject showed marks of molecular relapse after 18 months of the treatment. Only two of 16 filgrastim-stimulated patients had BCR-ABL levels in the blood and in collected PBPC below DL. In other subjects BCR-ABL transcripts were determined within the measurable range of RT-PCR. Conclusions. Taking into account prognostic importance, the measurement of BCR-ABL transcripts is an effective approach to monitoring of residual CML kinetics. Evaluation of BCR-ABL levels in collected PBPC can complete information on quality of the cells in potential autotransplants, and choose subsequent therapeutic protocols and patient prognosis.

• MeSH
• antitumorózní látky aplikace a dávkování   farmakologie   MeSH
• bcr-abl fúzové proteiny krev   MeSH
• chemorezistence MeSH
• chronická myeloidní leukemie diagnóza   farmakoterapie   genetika   MeSH
• faktor stimulující kolonie granulocytů aplikace a dávkování   MeSH
• imatinib mesylát MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   MeSH
• prognóza MeSH
• reziduální nádor diagnóza   farmakoterapie   genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• ženské pohlaví MeSH

BACKGROUND: In human body fluids, microRNA (miRNA) can be found as circulating cell-free miRNA (cfmiRNA), as well as secreted into extracellular vesicles (EVmiRNA). miRNAs are being intensively evaluated as minimally invasive liquid biopsy biomarkers in patients with cancer. The growing interest in developing clinical assays for circulating miRNA necessitates careful consideration of confounding effects of preanalytical and analytical parameters. METHODS: By using reverse transcription quantitative real-time PCR and next-generation sequencing (NGS), we compared extraction efficiencies of 5 different protocols for cfmiRNA and 2 protocols for EVmiRNA isolation in a multicentric manner. The efficiency of the different extraction methods was evaluated by measuring exogenously spiked cel-miR-39 and 6 targeted miRNAs in plasma from 20 healthy individuals. RESULTS: There were significant differences between the tested methods. Although column-based extraction methods were highly effective for the isolation of endogenous miRNA, phenol extraction combined with column-based miRNA purification and ultracentrifugation resulted in lower quality and quantity of isolated miRNA. Among all extraction methods, the ubiquitously expressed miR-16 was represented with high abundance when compared with other targeted miRNAs. In addition, the use of miR-16 as an endogenous control for normalization of quantification cycle values resulted in a decreased variability of column-based cfmiRNA extraction methods. Cluster analysis of normalized NGS counts clearly indicated a method-dependent bias. CONCLUSIONS: The choice of plasma miRNA extraction methods affects the selection of potential miRNA marker candidates and mechanistic interpretation of results, which should be done with caution, particularly across studies using different protocols.

• MeSH
• Caenorhabditis elegans chemie   MeSH
• chemická frakcionace metody   MeSH
• cirkulující mikroRNA krev   izolace a purifikace   MeSH
• extracelulární vezikuly chemie   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• nádorové biomarkery krev   izolace a purifikace   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   MeSH
• senioři MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• multicentrická studie MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

BACKGROUND: Detection of melanoma cells in peripheral blood is a promising method for monitoring haematogenous spread of melanoma cells. It enables us to detect early metastasis and to better stratify candidates for adjuvant immunotherapy. Inconsistent data on the sensitivity and clinical relevance of this method have been reported. STUDY DESIGN: We developed a multimarker real-time reverse transcription-PCR (RT-PCR) for quantification of five melanoma markers: Melan-A, gp100, MAGE-3, MIA and tyrosinase. In this prospective study, 65 patients with resected cutaneous melanoma stage IIB-III were screened. Peripheral blood samples were collected every 3 months for the following 18 months, and circulating melanoma cells were examined and compared with clinical staging results. RESULTS: Eighteen patients relapsed during the trial and showed different types of melanoma progression. All these patients experienced statistically significant tumour marker elevation in the period from 0 to 9 months before the disease progression. MAGE-3 was the most sensitive progression marker. In patients with progression, we observed three concordant positive markers in 39% of cases, two concordant positive markers in 28%, and finally one marker in 33%. CONCLUSIONS: This report describes a multiple-marker real-time RT-PCR, which is able to provide quantitative data on melanoma markers in the peripheral blood of melanoma patients. Measurement of the studied molecular markers in our hands represents a prognostic factor and a useful method for early detection of metastasis and treatment response of melanoma patients.

• MeSH
• antigeny nádorové genetika   krev   MeSH
• antigeny sacharidové asociované s nádorem genetika   krev   MeSH
• dospělí MeSH
• financování organizované MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• melanom krev   patologie   MeSH
• membránové glykoproteiny genetika   krev   MeSH
• nádorové biomarkery krev   MeSH
• nádorové buněčné linie MeSH
• nádorové proteiny krev   MeSH
• nádory kůže krev   patologie   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   MeSH
• progrese nemoci MeSH
• senioři MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• tyrosinasa genetika   krev   MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• klinické zkoušky kontrolované MeSH

BACKGROUND: Carcinoembryonic antigen (CEA) and cytokeratin 20 (CK20) are established tumour markers and the CEA pre-operative levels in serum have prognostic value. The aim of this study was to verify the usefulness of the estimation of CEA and CK20 gene expressions in tissues of colorectal cancers and their liver metastases. PATIENTS AND METHODS: Two hundred and twenty-two specimens of colorectal cancers, their liver metastases, other liver tumours and control tissues were analysed by reverse transcription combined with real-time PCR. RESULTS: The expressions of CEA and CK20 were significantly higher in tumours than in controls; there were differences between tumour types and no relationship to staging or clinical development was found. CK20 expression was inversely dependent on grading. The CEA expression in tumours did not correlate with the CEA levels in serum, but did correlate with serum tissue-specific polypeptide antigen (TPS). CONCLUSION: The measurement of CEA and CK20 gene expressions in tumours did not supply any new prognostic information, but raised the question of the mechanism releasing CEA into the blood.

• MeSH
• adenokarcinom genetika   imunologie   patologie   sekundární   MeSH
• dospělí MeSH
• exprese genu MeSH
• financování organizované MeSH
• karcinoembryonální antigen biosyntéza   genetika   krev   MeSH
• keratin-20 MeSH
• keratiny biosyntéza   genetika   krev   MeSH
• kolorektální nádory genetika   imunologie   krev   MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• messenger RNA biosyntéza   genetika   MeSH
• nádorové biomarkery krev   MeSH
• nádory jater genetika   imunologie   sekundární   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• staging nádorů MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH

In healthy humans, 60-70% of the B lymphocytes produce kappa light chains, while the remaining cells produce lambda light chains. Malignant transformation and clonal expansion of B lymphocytes lead to an altered kappa : lambda expression ratio, which is an important diagnostic criteria of lymphomas. Here, we compared three methods for clonality determination of suspected B cell lymphomas. Tumor biopsies from 55 patients with B cell malignancies, 5 B-lymphoid tumor cell lines, and 20 biopsies from patients with lymphadenitis were analyzed by immunohistochemistry, flow cytometry, and reverse transcription quantitative real-time PCR. Clonality was determined by immunohistochemistry in 52/53 cases, flow cytometry in 30/39 cases, and reverse transcription quantitative real-time PCR in 33/55 cases. In conclusion, immunohistochemistry was superior to flow cytometry and reverse transcription quantitative real-time PCR for clonality identification. Flow cytometry and reverse transcription quantitative real-time PCR analysis has complementary values. In a considerable number of cases tumor cells produced both kappa and lambda light chain transcripts, but only one type of light chain peptide was produced.

• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

Cíl práce: Cílem tohoto sdělení je prezentovat výsledky dvou komerčně dostupných souprav určených pro rutinní detekci rotaviru A v lidské stolici ve srovnání s komerčně dostupným kvantifikačním reverzně transkripčním PCR (RT-qPCR) testem a vlastním RT-qPCR testem. Materiál a metody: Celkem bylo vyšetřeno všemi čtyřmi metodami 749 vzorků stolice získaných ze čtyř diagnostických laboratoří v průběhu období od března 2016 do června 2017. U jedné třetiny vyšetřených pacientů byla uvedena diagnóza související s postižením gastrointestinálního traktu, zbytek vyšetřených vzorků byl odebrán od pacientů s jinými základními diagnózami. Vzorky byly vyšetřeny metodou enzymatické imunoanalýzy (EIA) (RIDASCREEN® Rotavirus) a rychlým imunochromatografickým testem (RDT) (IMMUNOQUICK® No-Rot-Adeno). Jako referenční metoda byl použit RT-qPCR test (Primerdesign™ Genesig® Kit), který byl také srovnán s vlastním RT-qPCR testem připraveným v naší laboratoři. U referenčního RT-qPCR testu byly vzorky s pozitivním signálem reakce v 28. a vyšším cyklu (Ct ≥ 28) hodnoceny jako negativní, aby byly do srovnání citlivosti metod zahrnuty pouze vzorky klinicky relevantní. Výsledky: U obou rutinních diagnostických testů byla stanovena citlivost (EIA - 84,2 %, RDT - 82,5 %) a také specificita (EIA - 97,8 %, RDT - 96,4 %). Prediktivní hodnota pozitivního testu byla 87,3 % pro EIA a 80,3 % pro RDT. Prediktivní hodnota negativního testu byla vypočítána jako 97,2 % pro EIA a 96,8 % pro RDT. Počet pozitivních vzorků zjištěných referenčním RT--qPCR testem s vlastní stanovenou hladinou cut-off byl 15,2 % (n = 114). Srovnání vlastního RT-qPCR testu a referenčního RT--qPCR testu ukázalo velmi dobrou shodu výsledků - citlivost vlastního testu byla 100 % a specificita 99,7 %. Závěry: Metoda RT-qPCR je pro sledování výskytu rotavirové gastroenteritidy citlivější metodou než rutinně používané testy EIA a RDT. Tyto dva testy ve srovnání s referenční metodou vykázaly velmi dobrou specificitu. Test EIA byl však ve všech sledovaných parametrech funkčnosti vyhodnocen lépe než RDT.

Objective: The aim of this study was to compare results of two commercially available kits used for routine detection of Rotavirus A in human stool samples with results of commercial quantitative reverse-transcription PCR (RT-qPCR) test and in-house RT-qPCR. Material and methods: In total, 749 stool samples were screen-ed with the use of four different methods. The samples were collected from four diagnostic laboratories from March 2016 to June 2017. Diagnose of gastrointestinal disorders was stated in one third of tested patients, the rest of samples was collected from patients with other primary diagnose. The samples were tested with the enzymatic immunoassay (EIA) (RIDASCREEN® Rotavirus) and with rapid diagnostic immunochromatographic test (RDT) (IMMUNOQUICK® No-Rot-Adeno). As a reference method a commercial RT-qPCR test was used (Primerdesign™ Genesig® Kit) and it was compared with in-house RT-qPCR test prepared in our laboratory. The samples which in the reference RT-qPCR gave positive signal of reaction in cycle 28 or higher (Ct ≥ 28) were assessed as negatives in order to include only samples with some clinical relevance into sensitivity determination. Results: Diagnostic sensitivity was assessed as 84.2% for EIA and 82.5% for RDT. The specificity of those tests was calculated as 97.8% for EIA and 96.4% for RDT. The performance of both diagnostic tests describing their positive predictive value was determined to be 87.3% for EIA and 80.3% for RDT. Negative predictive value was calculated to be 97.2% for EIA and 96.8% for RDT. Proportion of RVA-positive samples determined with the reference RT-qPCR test with our own cut-off level was 15.2% (n=114). Comparisons of the in-house and reference RT-qPCR tests showed very good agreement of results. The sensitivity of the in-house test was 100% and its specificity 99.7%. Conclusions: RT-qPCR is more sensitive for surveillance of rotavirus gastroenteritis than routinely used EIA or RDT methods. The specificity of both evaluated tests was very high. However, EIA was in all performance parameters assessed better than RDT.

• MeSH
• chromatografie afinitní MeSH
• feces mikrobiologie   MeSH
• gastroenteritida diagnóza   MeSH
• imunoanalýza MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí MeSH
• Rotavirus * izolace a purifikace   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

• MeSH
• akutní lymfatická leukemie * diagnóza   MeSH
• dítě MeSH
• fúzní onkogenní proteiny * genetika   MeSH
• imunoglobuliny genetika   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí * metody   MeSH
• prospektivní studie MeSH
• protein PEBP2A2 MeSH
• receptory antigenů T-buněk genetika   MeSH
• reziduální nádor * diagnóza   MeSH
• Check Tag
• dítě MeSH
• lidé MeSH
• Publikační typ
• dopisy MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• srovnávací studie MeSH