real-time PCR
Dotaz
Zobrazit nápovědu
Přestože PCR detekce mykotických patogenů v klinických vzorcích se na stránkách odborných časopisů objevuje již více než dvacet let, je použití této metody pro rutinní diagnostiku invazivní aspergilózy stále diskutabilní. A to i přesto, že metody molekulární biologie již našly své stálé místo v mnoha odvětvích moderní mikrobiologie. Genotypizace bakteriálních kmenů rezistentních na antibiotika, molekulární epidemiologie, ale i rutinní detekce, např. virových infekcí z nejrůznějších klinických materiálů je v dnešní době zcela běžnou praxí. Ve všech těchto oblastech znamenalo zavedení metody PCR diagnostiky zrychlení, zfpřesnění a zjednodušení celého procesu. Tento přehledový článek má za cíl ukázat, v čem je detekce původců mykotických infekcí jiná a proč se ji dosud nepodařilo zavést do rutinní praxe.
PCR detection of fungal pathogens in clinical samples has been discussed in journals for more than two decades. However, its use for diagnosing invasive aspergillosis is still controversial, despite the fact that molecular methods are routinely used in various fields of modern microbiology. These are e. g. genotyping of bacterial strains resistant to antibiotics, molecular epidemiology or routine detection of viral infections in clinical material. PCR methods have made the diagnostic apphcations faster, simpler and more accurate. This review deals with issues related to molecular methods for diagnosing invasive fungal infections and the main factors limiting their use in everyday clinical practice.
Real-time PCR je citlivá metoda pro analýzu RNA založená na základě měření fl uorescence. Je využívána v základním výzkumu, molekulární medicíně a v biotechnologiích. Kvantitativní PCR je jednoduchá, s vysokou citlivostí a spolehlivostí. Tato technika se rychle rozvíjí s objevem nových enzymů, chemikálií a přístrojů a slouží mimo jiné k potvrzení dat získaných pomocí sledování genové exprese mikročipovou analýzou. Tato práce seznamuje s principem real-time PCR a popisuje její využití ve studiu mnohočetného myelomu a celkově v hematologii.
Real-time PCR is a sensitive method for RNA analysis based on fl uorescence measurement. It is used in basic research, applied molecular medicine, and biotechnology. Real-time PCR assays are easy to perform and combine high sensitivity with reliability. The technology is evolving rapidly with the introduction of new reagents and instrumentation. It can be used for the confi rmation of data acquired by microarray analysis of gene expression. We review basic principles of real-time PCR and describe its application in hematology and especially in multiple myeloma research.
Cíl: Zavedení, charakterizace a porovnaní dvou metod kvantitativního stanovení viru hepatitidy B-HBV DNA. Obě metody používají totožného principu měření na bázi reál time PCR. První z nich je prováděna pomocí analytického systému LightCycler Roche Diagnostics a druhá na přístroji Rotorgene Corbett Research. Předmětem porovnávání metod byla linearita a pracovní rozsah stanovení, mez detekce, klinická senzitivita a specifičnost obou metod a jejich diagnostická správnost. Materiál: Oběma metodami bylo simultánně analyzováno 68 sér pacientů s diagnostikovanou chronickou hepatitidou B v různých fázích choroby. Výsledky: Regresní analýzou jsme stanovili hodnotu korelačního koeficientu r= 0,995 (p < 0,0001), potvrzující velmi úzký vztah mezi souborem výsledků získaných oběma metodami. Přesnost měření obou metod nepřekračuje hodnotu CV = 15 %. Obě metody disponují vysokým rozsahem linearity měření v intervalu lO 3-lO 8 kopií HBV DNA/ml. Diagnostická správnost srovnávaných metod byla vyhodnocena ROC analýzou. Pro obě metody byla zjištěna hodnota klinické sensitivity 100 %, klinická specifičnost metody LightCycler činila 96 % ve srovnání s 95 % u metody Rotorgene. Klinická efektivita, vyjádřená hodnotou AUC (plochy pod krivkou) byla 0,995 (LightCycler) respektive 0,994 (Rotorgene). Metoda LightCycler vykázala vyšší hodnotu pozitivního pravděpodobnostního poměru + LR = 26 oproti hodnotě 19,5 u Rotorgenu. Závěr: Uvedené údaje vypovídají o velmi vysoké hodnotě klinické užitečnosti obou metod.
Objective: Introduce, characterize and compare two methods of hepatitis virus B DNA quantification in serum. Both methods are based on real time PCR principle. Two measurement systems, LightCycler Roche and Rotorgene Corbett Research were used. We evaluated and compared their precision, linearity, limit of detection, clinical sensitivity, clinical specificity and diagnostic accuracy. Materials: By use of mentioned methods we analysed 68 sera from patients with diagnosed chronic hepatitis B in different stages of disease. Results: Correlation coefficient 0,995 (p < 0,0001) obtained by linear regression analysis shows excellent relationship between results of evaluated methods. The coefficients of variation for repeatability and reproducibility indicate very good measurement precision and are in all cases lower than 15 %. Linearity of both methods has very broad range lO 3 -lO 8copies of HBV DNA/ml. It means that majority of samples may be analysed without repeating after sample dilution. By use of ROC analysis we determined AUC value 0,995, clinical sensitivity 100 %, specificity 96 % and positive likelihood ratio (+LR) 26,0 for LightCycler, resp. AUC = 0,994, specificity 95 %, +LR = 19,5 for Rotorgene. Conclusion: All analytical and clinical characteristics of introduced methods show their usefulness for diagnosis and treatment of chronic hepatitis B.
- MeSH
- amplifikace genu MeSH
- antrax diagnóza imunologie MeSH
- DNA bakterií genetika MeSH
- dospělí MeSH
- fluorescence MeSH
- lidé MeSH
- polymerázová řetězová reakce metody přístrojové vybavení MeSH
- zdroje nemoci MeSH
- Check Tag
- dospělí MeSH
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- kazuistiky MeSH
- přehledy MeSH
- Geografické názvy
- Slovenská republika MeSH
Cílem předkládané práce je shrnutí výsledků průkazu Bordetella pertussis (BP) a Bordetella parapertussis (BPP) metodou real-time PCR a sérologickými testy. V letech 2008–2010 bylo vyšetřeno na možnou přítomnost onemocnění pertusí 73 pacientů Oddělení klinické imunologie a alergologie Centra imunologie a mikrobiologie ZÚ Ústí nad Labem, vybraných podle kritérií WHO a ECDC, tj. s perzistencí kašle déle než 2 týdny. Přímý průkaz DNA BP a BPP byl proveden soupravou pro real-time PCR z výplachu nosohltanu. Sérologická odpověď byla sledována metodou přímé aglutinace celkových protilátek a stanovením protilátek proti pertusovému toxinu ve třídách IgG, IgA a IgM metodou ELISA. Do souboru pacientů s prokázanou infekcí BP a/nebo BPP bylo zařazeno 42 jedinců rozdělených do dvou skupin: průkaz onemocnění metodou PCR (skupina A, n = 19), průkaz onemocnění pouze sérologickými metodami (skupina B, n = 23), přičemž pacienti ze skupiny A v 10 případech (52,6 %) vykazovali rovněž pozitivitu protilátkové odpovědi. Z našich výsledků je zřejmé, že pertuse by neměla být opomíjenou infekcí. Věříme, že zvýšená informovanost zdravotnické veřejnosti spolu se zkvalitněním laboratorních postupů pomohou v budoucnu odhalit vyšší procento případů nakažených touto, pro řadu lékařů stále ještě vnímanou jako „dětskou“, infekcí.
The goal of this study is to summarize the results of the detection of Bordetella pertussis (BP) and Bordetella parapertussis (BPP) by a real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) assay and serological methods. In 2008–2010, 73 patients of the Department of Clinical Immunology and Allergology of the Centre for Immunology and Microbiology, Public Health Institute in Ústí nad Labem were screened for pertussis. They were selected according to the WHO and ECDC criteria, i. e. they presented with a persistent cough lasting more than two weeks. Direct detection of BP and BPP DNA from nasopharyngeal wash specimens was performed using a RT PCR assay. The serological responses were evaluated by a direct agglutination test for the detection of total antibodies and by enzyme-linked immunosobent assay (ELISA) for the detection of IgG, IgA, and IgM antibodies against pertussis toxin. Forty-two patients were positive for BP and/or BPP, 19 of them by RT-PCR (group A) and 23 by serology (group B). Ten group A patients (52.6%) were also positive by serology. Our results show that pertussis needs to be a consideration in persistent cough. We believe that increased awareness of the medical community, along with improved laboratory tests will result in increased detection of pertussis that is still considered by many physicians as a childhood infection.
- Klíčová slova
- černý kašel, perzistující kašel,
- MeSH
- aglutinační testy * statistika a číselné údaje MeSH
- Bordetella parapertussis imunologie izolace a purifikace MeSH
- Bordetella pertussis imunologie izolace a purifikace MeSH
- dítě MeSH
- dospělí MeSH
- ELISA statistika a číselné údaje MeSH
- kašel etiologie MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce * statistika a číselné údaje MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mladiství MeSH
- následné studie MeSH
- pertuse * diagnóza epidemiologie imunologie MeSH
- pertusový toxin imunologie MeSH
- předškolní dítě MeSH
- reagenční diagnostické soupravy MeSH
- rodina MeSH
- senioři MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- zdraví rodiny MeSH
- Check Tag
- dítě MeSH
- dospělí MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mladiství MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- předškolní dítě MeSH
- senioři MeSH
- ženské pohlaví MeSH
Cíl studie: Doposud používaný ABI PRISM 7700 sekvenční detekční systém se již přestal vyrábět, řada laboratoří je proto nucena převést dosavadní neinvazivní prenatální diagnostiku na nové přístrojové vybavení. V této studii se zaměřujeme na testování použití 7300 real-time PCR systému pro účely rutinního neinvazivního určení pohlaví, RHD a RHCE genotypu plodu. Název a sídlo pracoviště: Laboratoř buněčné biologie, Pediatrická klinika, 2. LF UK a FN Motol Praha. Materiál a metody: Hodnotíme amplifikaci paternálních alel na extracelulární DNA izolované z mateřské periferní krve pomocí QIAamp DSP Virus kitu (c a E alely RHCE genu) a QIAamp DNA Blood Mini kitu (SRY, RHD a C alela RHCE genů) u 22 těhotných žen v rozmezí 10.–38. týdne gravidity. Výsledky: SRY (n = 6), RHD (exon 7 a exon 10, n = 7) a RHCE (C alela, n = 3; c alela, n = 3; E alela, n = 3) genotypizace plodu provedené na 7300 real-time PCR systému byly ve shodě s pohlavím a Rh fenotypem plodu či narozeného dítěte u všech vyšetřených těhotných žen. Závěr: Prokázali jsme, že 7300 real-time PCR systém je dostatečně citlivý pro detekci paternálních alel na fetální DNA přítomné v extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy. Tímto způsobem můžeme nadále i po vyřazení ABI PRISM 7700 sekvenčního detekčního systému z provozu zajišťovat spolehlivé neinvazivní určení pohlaví plodu u těhotenství s rizikem X-vázaných onemocnění u plodu a neinvazivní RHD a RHCE genotypizaci plodu u aloimunizovaných těhotenství s rizikem fetální erytroblastózy.
Objective: Since ABI PRISM 7700 sequence detection system has not already been commercially available, quite a number of laboratories are obliged to perform actual non-invasive prenatal diagnosis from maternal peripheral blood on new equipment. The purpose of this study was to test the usage of 7300 real-time PCR system for the purpose of routine non-invasive fetal sex determination and fetal RHD and RHCE genotyping. Settings: Cell Biology Laboratory, Paediatric Clinic, 2nd Medical Faculty and University Hospital Motol Prague. Material and Methods: We evaluated paternal allele amplification on extracellular DNA isolated from maternal peripheral blood by using QIAamp DSP Virus kit (c and E alleles of RHCE gene) and QIAamp DNA Blood Mini kit (SRY, RHD and C allele of RHCE gene) in a cohort of 22 pregnant women within 10th and 38th week of pregnancy. Results: The results of fetal SRY (n = 6), RHD (exon 7 and exon 10, n = 7) and RHCE (C allele, n = 3; c allele, n = 3; E allele, n = 3) genotyping performed on 7300 real-time PCR system corresponded to sex and/or Rh phenotype of the foetus or the newborn in all tested pregnant women. We showed that 7300 real-time PCR system is sensitive enough for paternal allele detection performed on fetal DNA fraction within extracellular DNA isolated from maternal plasma. Conclusion: After ABI PRISM 7700 sequence detection system would be completely taken out of service, we would be able henceforth to provide reliable non-invasive fetal sex determination in pregnancies at risk of X-linked disorders and non-invasive fetal RHD and RHCE genotyping in alloimmunized pregnancies at risk of haemolytic disease of newborn.
- MeSH
- amplifikace genu fyziologie genetika MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- geny sry fyziologie genetika MeSH
- lidé MeSH
- polymerázová řetězová reakce metody trendy využití MeSH
- procesy určující pohlaví MeSH
- sekvenční analýza DNA metody využití MeSH
- těhotenství genetika krev MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- těhotenství genetika krev MeSH
Východisko. Molekulárně biologické metody založené na reverzní transkripci a následné polymerázové řetězové reakci (RT-PCR) jsou schopny detekovat přítomnost transkriptu BCR-ABL u chronické myeloidní leukémie (CML). V tomto sdělení prezentujeme naše zkušenosti se sledováním reziduální leukémie metodou real-time PCR s detekcí hybridizačními sondami u nemocných s CML léčených imatinibem a při sběru periferních krvetvorných buněk (PKB). Metody a výsledky. Stanovení hladin transkriptu BCR-ABL v periferní krvi bylo provedeno u 27 osob před nasazením a v průběhu léčby imatinibem mesylátem. Medián relativního množství BCR-ABL v periferní krvi před nasazením imatinibu byl 2,55 %. Množství transkriptu u 23 osob bez rezistence vůči imatinibu pokleslo během prvních šesti měsíců léčby na hodnotu 0,02 %. Po dvanáctiměsíční léčbě poklesl medián množství transkriptu na 0,005 %. V dalším průběhu léčby hladiny BCR-ABL kolísaly mezi hodnotami pod detekčním limitem metody (0,001 %) a 0,005 %. Tři pacienti byli vůči imatinibu primárně rezistentní s rozsahem hodnot od 0,13 % do 11,7 %. Jeden pacient vykazoval po 18 měsících léčby známky molekulárního relapsu. Z 16 pacientů po stimulaci PKB filgrastimem měly pouze dvě vyšetřované osoby hodnoty BCR-ABL v periferní krvi i v PKB pod detekčním limitem použité metody. U ostatních osob se koncentrace fúzního transkriptu pohybovala v koncentracích spolehlivě stanovitelných metodou RT-PCR. Závěry. Vzhledem k svému prognostickému významu je vyšetření BCR-ABL vhodné pro monitorování kinetiky reziduální choroby. Stanovení provedené v koncentrátu PKB jako potenciálním autotransplantátu může kompletovat informace o kvalitě těchto buněk z hlediska proporce BCR-ABL transkriptu a nastínit další možné terapeutické postupy a prognózu pacienta.
Background. Molecular biology methods based on reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) are able to detect the presence of BCR-ABL transcripts in chronic myeloid leukemia (CML). In this study we present our experience with monitoring of residual disease using real-time PCR with hybridization probes detection in patients treated with imatinib mesylate and in collected peripheral blood progenitor cells (PBPC). Methods and Results.We measured the level of BCR-ABL transcripts in peripheral blood cells of 27 subjects before and in the course of the imatinib treatment. The median of relative quantity of BCR-ABL in the blood before imatinib therapy was 2.55%. The number of the transcripts in 23 imatinib-sensitive subjects decreased to 0.02% in 6 months. After 12 months of the treatment the BCR-ABL median was 0.005%. Subsequent levels fluctuated between values below the detection limit (DL, 0.001%) and 0.005%. Three patients were primarily resistant to imatinib with the BCR-ABL range of 0.13%-11,7% during the treatment. One subject showed marks of molecular relapse after 18 months of the treatment. Only two of 16 filgrastim-stimulated patients had BCR-ABL levels in the blood and in collected PBPC below DL. In other subjects BCR-ABL transcripts were determined within the measurable range of RT-PCR. Conclusions. Taking into account prognostic importance, the measurement of BCR-ABL transcripts is an effective approach to monitoring of residual CML kinetics. Evaluation of BCR-ABL levels in collected PBPC can complete information on quality of the cells in potential autotransplants, and choose subsequent therapeutic protocols and patient prognosis.
- MeSH
- bcr-abl fúzní proteiny krev MeSH
- chemorezistence MeSH
- chronická myeloidní leukemie diagnóza farmakoterapie genetika MeSH
- faktor stimulující kolonie granulocytů aplikace a dávkování MeSH
- imatinib mesylát MeSH
- lidé MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody MeSH
- prognóza MeSH
- protinádorové látky aplikace a dávkování farmakologie MeSH
- reziduální nádor diagnóza farmakoterapie genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
Cíl práce: 1. zavedení, optimalizace a validace polymerázové řetězové reakce v realném čase pro detekci DNA borélií včetně kontroly přítomnosti inhibitorů DNA polymerázy; 2. shrnutí dosavadních výsledků získaných pomocí zavedené metody. Materiál a metody: Izolace DNA byla prováděna pomocí komerčního kitu MagNA Pure Isolatin Kit III (Bacteria, Fungi) na automatickém izolačním přístroji MagNA Pure LC fi rmy Roche. Metoda byla koncipována jako multiplex real-time PCR s amplifi kací DNA borélií a koamplifi kací inhibiční kontroly v jedné zkumavce. Výsledky: Zavedená metoda byla plně optimalizována, validována a následně použita pro vyšetření 1822 materiálů, z toho 1151 likvorů, 609 krví a 62 jiných materiálů. Pouze 17 vzorků bylo pozitivních a 4 vzorky vykazovaly přítomnost inhibitorů DNA polymerázy. Závěr: Námi zavedená a validovaná metoda je velice rychlá, citlivá a specifi cká pro detekci DNA borélií. Přesto v diagnostice lymeské boreliózy není vždy stoprocentně spolehlivá a klinická korelace, stejně jako u jiných metod, není uspokojivá.
Objective: The aims of our work were to introduction, optimization and validation of real-time PCR for detection Borrelia DNA including control of DNA polymerase inhibitors presence and summary of the results obtained by the new method. Material and methods: DNA was isolated by commercial kit MagNA Pure Isolatin Kit III (Bacteria, Fungi) on automatic isolation instrument MagNA Pure LC (Roche). The method is created as multiplex real-time PCR with Borrelia DNA amplifi cation and co-amplifi cation of inhibitor control in one tube. Results: Established method was optimised, validated and then used for analysis of 1,822 biological materials, of it 1,151 cerebrospinal fl uids, 609 blood samples and 62 other biological samples. Only 17 samples were positive and 4 samples contained inhibitors of DNA polymerase. Conclusion: The established and validated method is very fast, sensitive and specifi c for detection of Borrelia DNA. In spite of, Lyme borreliosis diagnostics is not always unimpeachable and clinical correlation is not satisfactory as well as other methods.
Cíl práce: Navržení a validace real-time PCR, vhodné pro kvantitativní průkaz C. pneumoniae a C. trachomatis v klinických vzorcích. Materiál a metody: Jako cílový úsek pro amplifikaci byla zvolena část genu pro 16S RNA. Pomocí klonování produktu reakce v bakteriálním plazmidu byl připraven rekombinantní kalibrátor a kombinovaný interní standard, který lze použít ve třech různých PCR. Pro validaci byly použity archivované izoláty DNA z různých klinických vzorků, izoláty DNA z dalších infekčních agens a kontrolní vzorky pro detekci DNA CT (QCMD) a CPN (Instand). Výsledky: Byla ověřena specificita a reprodukovatelnost reakce. Analytická citlivost byla stanovena na 5–10 kopií bakteriálního genomu/reakci. 105 izolátů DNA z různých typů klinických vzorků (výtěry, moče, periferní krev, BAL) bylo vyšetřeno pomocí real-time PCR a konvenční PCR. Vzorky, které poskytly nesouhlasný výsledek, byly charakterizovány pomocí třetího nezávislého amplifikačního testu. Citlivost a specificita real-time PCR byla 89 % a 100 %. Metoda je vhodná pro screening i diagnostiku chlamydií.
Study objective: Design and validation of a real-time PCR assay for quantitative detection of C. pneumoniae and C. trachomatis in clinical specimens. Material and Methods: A part of the 16S RNA gene was selected as the target sequence for amplification. The reaction product was cloned in the bacterial plasmid and a recombinant calibrator and a combined internal standard were prepared, usable in three different PCR assays. Archived DNA isolates from various clinical specimens, DNA isolates from other infectious agents and control samples for DNA detection, CT (QCMD) and CPN (Instand), were used for validation. Results: Reaction specificity and reproducibility were tested. The analytical sensitivity was set to 5–10 copies of the bacterial genome/reaction. As many as 105 DNA isolates from various types of clinical specimens (swabs, urine, peripheral blood and BAL fluid) were tested by real-time PCR and conventional PCR assays. The specimens that had not yielded concordant results were characterized by a third independent amplification test. The sensitivity and specificity of real-time PCR were 89 % and 100 %, respectively. The assay is suitable for both screening and diagnosis of Chlamydia.
- MeSH
- Chlamydia trachomatis genetika imunologie izolace a purifikace MeSH
- Chlamydophila pneumoniae genetika imunologie izolace a purifikace MeSH
- financování organizované MeSH
- genetické testování metody využití MeSH
- lidé MeSH
- mikrobiologické techniky metody využití MeSH
- polymerázová řetězová reakce metody využití MeSH
- sekvenční analýza DNA metody využití MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
