Komplexrií vyšetřování svalových dystrofií pomocí klinických, bioptických a molekulárně genetických diagnostických metod se v naší zemi dosud provádělo pouze ve velmi omezeném rozsahu. Naše skupina (kliiiiků, patologů a genetiků) vyšetřila od roku 1992 do roku 2000 přibližně 240 pacientů suspektních ze svalové dystrofie. Většina pacientů pochází z jihomoravského a severomoravského regionu. Pacienti byli k vyšetření odesíláni zeiména z kUnik a oddělení neurologie a dětské neurologie, dále z odděleni klinické genetiky a méně často z interních klinik a oddělení. Vyšetřovaní pacienti byli podle závěrečné diagnózy rozděleni do skupin pacientů s dystrofinopatií (DMD a BMD), přenašeček dystrofinopatií, pacientů s kongenitální svalovou dystrofií s deficitem merosinu a pacientů s Emery-Dreifussovou svalovou dystrofií, včetně přenašeček tohoto onemocnění. Někteří členové rodin, v nichž se vyskytla dystrofinopatie, byli následně vyšetřeni metodami segregační analýzy. Pacienti DMD/BMD mohou být pomoci molekulárně genetických metod zachyceni ve vysokém procentu. Metoda vyšetření mRŇA pomocí RT PCR a PTT z biopsie dovoluje detegovat delece, duplikace, ale i bodové mutace dystrofinového genu, a tím má vyšší diagnostický rozsah než vyšetření DNA lymfocytů periferní krve metodou multiplex PCR, které zachytí 65 % všech mutací, prakticky jenom delece. Imunofenotypizace dystrofinu se uplatní zejména v odhalování DMD. Deficit sarkolemové reaktivity v karboxytermmální a střední doméně (Dys 1 a Dys 2) jednoznačně signalizuje defektní dystrofiu. Naproti tomu menší deficity dystrofinu u BMD (a též u přenašeček) nemusejí být v biopsii zachyceny. V těchto případech je nutné doplnit vyšetření imunoblotingem nebo analýzou genotypu. Vyšetřování pacientů s klinicky diagnostikovanou svalovou dystrofií by mělo většinou začít vyšetřením biopsie, z níž je možno odhadnout přítomnost a stupeň strukturálních změn, a aplikací protilátek proti DGC případně odhalit patřičný deficit. Imunohistochemické vyšetření je možné doplnit imunoblotingem a tak navést další molekulárně genetické vyšetření DNA či mRNA. Svalovou biopsii je možno v případě deficitu merosinu a emerinu nahradit méně invazivními metodami, jako kožní biopsií nebo výtěrem z bukální sliznice. Při deficitech proteinů DGC je nutno při interpretaci nálezů respektovat možnost sekundární alterace jiných složek, a tak imunohistochemie sama o sobě nemusí být dostatečně informativní. Identifikace a bližší diagnostické zařazení pacientů s deficitem merosinu, sarkoglykanů, emerinu, kalpainu a dalších je možné díky možnosti použití protilátek, které jsou na trhu. Detekce těchto pacientů v naší zemi teprve čeká na jejich soustavné vyhledávání opřené o aplikaci metod popsaných a diskutovaných v tomto sdělení.

Complex diagnosis of muscular dystrophies including clinical, bioptical and molecular genetic approaches has been provided in a limited extent in this country. Our group of neurologists, pathologists and geneticists has examined approximately 240 patients suspected of having muscular dystrophies, mostly coming from Southern and Northern Moravia. The patients were sent to the examination most often firom departments of neurology and clinical genetics, and less firequently fi:om departments of internal medicine. According to the final diagnosis, the patients were divided into groups: with dystrophinopathies and carriers of dystrophinopathies (DMD/BMD), merosin deficient form of congenital muscular dystrophy, and Emery-Dreifuss muscular dystrophy including the carriers of this disease. Some relatives of patients with dystrophinopathies were also examined using the methods of segregation analysis. High proportion of the DMD/BMD patients can be detected by the methods of molecular genetics. Analysis of mRNA using RT PCR and PTT enables the detection of deletions, dupUcations, and point mutations in dystrophin gene and encompasses a larger diagnostic scope in comparison with examinations of DNA level by the multiplex PCR method from the peripheral blood which enables only deletion detections. Immunophenotyping of the dystrophin protein plays an important role especially using antibodies against carboxyterminal (DYS2) and rod domain (DYSl) of dystrophin. Deficient sarcolemmal expression of DYS2 and DYSl reveales unambiguously a pathological dystrophin. On the other hand, less pronounced deficiencies in dystrophin expression in BMD patients and DMD/BMD carriers may not always be detected in muscle biopsies. In this case, it is necessary to supplement the examination by Western blotting and genotype analysis. The examination of patients with clinically diagnosed muscular dystrophy shoidd start with á muscle biopsy which enables the estimation of presence and degree of structural changes. Application of antibodies against the components of DGC and emerin may reveal a deficiency in expression of these proteins. Immunohistochemical examination completed by Western blotting leads to the subsequent molecular genetic analysis of DNA or mRNA. Secondary deficiencies in expression of other DGC proteins are often revealed in muscle biopsies of dystrophinopathies and this fact must be taken into account in the evaluation of immunohistochemical findings. There is a possibility of replacement of invasive muscle biopsy by skin biopsy or buccal mucosal smears in cases of merosin and emerin deficiencies. Commercially available antibodies against merosin, emerin, calpain and sarcoglycans enable extensive identification and detailed classification of muscular dystrophies. Screening of the patients based on the application of methods described and discussed in this report is the task of the forthcoming period.

• MeSH
• DNA analýza   MeSH
• genotyp MeSH
• imunofenotypizace metody   MeSH
• messenger RNA analýza   MeSH
• molekulární biologie metody   MeSH
• svalové dystrofie diagnóza   genetika   patologie   MeSH
• svalový tonus MeSH

Východiska: Dlouhé nekódující RNA (long non-coding RNA – lncRNA) jsou RNA molekuly o délce větší než 200 nukleotidů, které ovlivňují řadu fyziologických funkcí a mají významnou regulační roli v buňkách. Jejich hladiny jsou často změněny u různých malignit, a představují tak slibný biomarker pro diagnostiku, prognózu nebo rekurenci nádorových onemocnění. Díky důležitosti těchto molekul výrazně roste i počet publikací na toto téma. Mezi nejčastěji studované lncRNA patří např. HOTAIR, MALAT1 a PCA3. Cíl: V současné době jsou vyvíjeny různé metody pro analýzu či detekci lncRNA, obvykle založené na optických metodách pro detekci mediátorové RNA (mRNA), např. polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí, fl uorescenční in situ hybridizace nebo sekvenování nové generace. Je však potřeba dbát na rozdíly ve struktuře mRNA a lncRNA. V této práci popisujeme nejenom standardní metody, ale i nové přístupy pro detekci lncRNA zahrnující např. chemiluminescenční a elektrochemické techniky. Závěr: I navzdory pokrokům a velkému množství publikovaných prací existuje pouze jeden schválený diagnostický test založený na detekci lncRNA, a to PCA3 test pro diagnostiku karcinomu prostaty analýzou moči. Ostatní jsou v současnosti pouze ve fázi vývoje a bude potřeba je validovat. Dia gnostika založená na lncRNA i tak skýtá obrovský potenciál, a je proto velmi pravděpodobné, že se v blízké době objeví další diagnostické testy cílící na jiné typy lncRNA.

Background: Long non-coding RNAs (lncRNA) are more than 200-nucleotide-long RNA molecules that affect multiple physiologic phenomena and have important regulatory functions in cells. Their levels are often altered in various malignancies, thus they represent a potential biomarker for the diagnostics, prognosis or recurrence of cancer. Their importance has recently led to an enormous increase in a number of publications on the subject. The most frequently studied lncRNAs are HOTAIR, MALAT1 and PCA3. Aim: Numerous methods are currently being developed for the analysis or detection of lncRNA. They are mostly based on optical methods used for the detection of messenger RNAs, including polymerase chain reaction with reverse transcription, fluorescence in situ hybridisation or next-generation sequencing, but caution must be taken due to their structural differences. Here, we describe not only standard but also novel techniques for lncRNA detection, including chemiluminescent and electrochemical techniques. Conclusion: Despite the great progress and plethora of papers on this topic, there is only one single approved lncRNA-based diagnostic test, a PCA3 test for the diagnosis of prostate cancer from the patient’s urine. All other tests are only in their research phase and need to be validated. Nevertheless, lncRNA diagnostics offer enormous potential and thus it is highly probable that other diagnostic tests on different lncRNA types will soon appear.

• MeSH
• biosenzitivní techniky metody   MeSH
• karcinogeneze MeSH
• lidé MeSH
• nádorové biomarkery * MeSH
• RNA dlouhá nekódující * analýza   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Expression of the nascent RNA transcript is regulated by its interaction with a number of proteins. The misregulation of such interactions can often result in impaired cellular functions that can lead to cancer and a number of diseases. Thus, our understanding of RNA-protein interactions within the cellular context is essential for the development of novel diagnostic and therapeutic tools. While there are many in vitro methods that analyze RNA-protein interactions in vivo approaches are scarce. Here we established a method based on fluorescence resonance energy transfer (FRET), which we term RNA-binding mediated FRET (RB-FRET), which determines RNA-protein interaction inside cells and tested it on hnRNP H protein binding to its cognate RNA. Using two different approaches, we provide evidence that RB-FRET is sensitive enough to detect specific RNA-protein interactions in the cell, providing a powerful tool to study spatial and temporal localization of specific RNA-protein complexes.

• MeSH
• genetické vektory genetika   MeSH
• HeLa buňky MeSH
• lidé MeSH
• proteiny vázající RNA genetika   metabolismus   MeSH
• rezonanční přenos fluorescenční energie metody   MeSH
• RNA analýza   metabolismus   MeSH
• sekvence nukleotidů MeSH
• substrátová specifita MeSH
• vazba proteinů MeSH
• vazebná místa MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• hodnotící studie MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• Research Support, N.I.H., Extramural MeSH

Bioorthogonal chemistry provides one of the possibilities to modify various biomolecules in their native environment. The combination of Click chemistry with the BONCAT method (bioorthogonal non-canonical amino acid tagging) is widely used for tagging and analysis of newly synthesized proteins, which are clearly distinguishable from the pre-existing protein pool. However, the commonly used procedure results in low quality 2D electrophoretic profiles. We put a lot of effort into obtaining clear results using a standard Click protocol, with a negligible effect. Here we describe a Click-on-membrane approach which we successfully used not only to monitor de novo protein synthesis but also to detect newly synthesized RNA.

• MeSH
• click chemie metody   MeSH
• proteiny analýza   MeSH
• RNA analýza   MeSH
• techniky kombinatorické chemie * metody   MeSH

• MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• ribonukleoproteiny MeSH
• RNA izolace a purifikace   MeSH
• sekvenční analýza RNA MeSH
• Publikační typ
• monografie MeSH

• Konspekt
• Biochemie. Molekulární biologie. Biofyzika
• NLK Obory
• biochemie
• molekulární biologie, molekulární medicína

Východiska: Spinocelulární karcinom dutiny ústní (oral squamous cell carcinoma – OSCC) je nejběžnějším typem zhoubných nádorů v oblasti hlavy a krku. Je známo, že cirkulární RNA (circRNA) hraje důležitou roli v karcinogenezi různých typů zhoubných nádorů. Role circRNA při OSCC však zůstává nejasná. Materiál a metody: Byly získány tkáně OSCC a přilehlé normální tkáně k detekci exprese circRNA sekvenováním nové generace (next generation sequencing – NGS) a byly vybrány tkáně OSCC k ověření circRNAs různého významu pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce s reverzní transkriptázou (reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction – RT-qPCR). Pro další zkoumání role hsa-circ-0006203 – hsa-circ-0004872 byl vytvořen design primeru a byla provedena RT-PCR. Hladiny exprese byly detekovány pomocí RT-qPCR. Výsledky: Výsledky NGS ukázaly, že u OSCC byly výrazně exprimovány circRNA, přičemž dvě circRNAs byly exprimovány výrazně odlišným způsobem. hsa-circ-0006203 – hsa-circ-0004872 byly ve vzorcích tkáně OSCC výrazně downregulována, což statisticky korelovalo s jejich patologickou diferenciací. Závěr: Souhrnně lze říci, že výsledky prezentované studie odhalily zvýšené množství circRNA ve tkáních OSCC a pokud je nám známo, náš tým jako první zkoumal regulační roli sítě hsa-circ-0006203 – hsa-circ-0004872 u OSCC. Výsledky ukázaly, že hsa-circ-0006203 – hsa-circ-0004872 může být případným biomarkerem OSCC.

Background: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common cancer of the head and neck region. The circular RNA (circRNA) is known to serve an important role in the carcinogenesis of different types of cancer. However, the circRNA role of OSCC remains unclear. Material and methods: OSCC tissues and adjacent normal tissues were obtained to detect circRNAs expression by the next generation sequencing (NGS), and OSCC tissues were selected to verify the differentially significant circRNAs by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). To further investigate the role of hsa-circ-0006203 – hsa-circ-0004872, the primer design and RT-PCR were performed. The expression levels were detected by RT-qPCR. Results: The NGS results demonstrated that circRNAs were abundantly expressed in OSCC, and two circRNAs were significantly differentially expressed. hsa-circ-0006203 – hsa-circ-0004872 were significantly downregulated in OSCC tissue samples and was statistically correlated with pathological differentiation. Conclusion: In summary, the results of the present study revealed that OSCC tissues have abundant circRNAs and, to the best of our knowledge, it was our team who firstly explore the regulatory role of the hsa-circ-0006203 – hsa-circ-0004872 network in OSCC. The results indicated that hsa-circ-0006203 – hsa-circ-0004872 may be a potential biomarker for OSCC.

• Klíčová slova
• hsa-circ-0006203, hsa-circ-0004872,
• MeSH
• klinická studie jako téma MeSH
• kruhová RNA MeSH
• lidé MeSH
• nádorové biomarkery MeSH
• nádory úst * diagnóza   genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• messenger RNA analýza   krev   MeSH
• northern blotting MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH

Epigenetika se zabývá tím, jak zevní i vnitřní faktory ovlivňují funkci DNA daného organizmu, aniž by se přitom měnila její sekvence. Epigenetické vlivy jsou významné jak v buňkách stávajících, tak dceřiných, a to v rámci jedince i mezigeneračního přenosu získaných znaků. Za nejvýznamnější epigenetické mechanizmy bývají považovány acetylace histonů a metylace DNA, k nim však přistupuje řada dalších molekulárních procesů. Vedle epigenetiky je dalším odvětvím molekulární biologie výzkum nekódující RNA, který se začíná uplatňovat také ve studiu psychických poruch. Nekódující RNA, vznikající především z tzv. nesmyslné DNA, ovlivňuje genovou expresi. I Epigenetické výzkumy doposud byly prováděny jen na tkáních in vitro, pokusných zvířatech a zemřelých nemocných. Chybí epigenetické klinické studie. Do budoucna se jako nadějná jeví epigenetická terapie kognitivních poruch, schizofrenie a poruch nálady. Přitom je možno využívat jak léků stávajících (např. valproát, klozapin, sulpirid, escitalopram, lithium), tak látek nově syntetizovaných. Problémem je, že epigenetické účinky uvedených látek nejsou topicky, tkáňově, enzymaticky či genově specifické. To může vést k závažným nežádoucím účinkům. V budoucnu je zapotřebí vyrábět substrátově specifická farmaka s epigenetickými účinky a začít jejich testování na lidech. Epigenetika nám může napomoci při překonávání farmakorezistence duševních poruch, případně v jejich časné detekci a prevenci.

Epigenetics deals with the influence of external as well as intrinsic factors on the DNA function in a given organism without t he chan- ge of DNA sequence. Epigenetic effects are significant in both currently existing cells and their daughter cells. This holds tr ue for an individual organism as well as intergenerational transmission of acquired signs. Histone acetylation and DNA methylat ion are considered as the most important epigenetic mechanisms. In addition to this, other molecular procedures have already been recognized, including non-coding RNA molecules which influence gene expression. Non-coding RNA is mostly synthesized based on so called nonsense DNA. Epigenetic research has only been performed on in vitro tissues, experimental animals and brain tissue of decea- sed psychiatric patients so far. Clinical epigenetic studies in the treatment of mental disorders are lacking. Epigenetic thera py of cognitive disorders, schizophrenia, and mood disorders seems to be promising for the future. In this effort, both existing medi caments (valproate, clozapine, sulpiride, escitalopram, lithium) and newly synthesized chemical substances can be utilized. The problem is that epigenetic effects of currently known substances are not specific for individual parts of the brain, brain cells, enzymes or ge nes. This may induce serious adverse effects. In the future, it is necessary to produce substrate-specific epigenetic medicaments, and start epigenetic cli- nical studies. Epigenetics can help us to overcome treatment resistance of mental disorders, and possibly detect and prevent th em early.

• Klíčová slova
• léčba, epigenetika, farmakorezistence,
• MeSH
• Alzheimerova nemoc genetika   patologie   terapie   MeSH
• cytosin biosyntéza   MeSH
• DNA modifikační methylasy MeSH
• duševní poruchy * diagnóza   farmakoterapie   prevence a kontrola   MeSH
• epigenomika * metody   trendy   MeSH
• exozómy MeSH
• exprese genu MeSH
• histony biosyntéza   MeSH
• klinické zkoušky jako téma MeSH
• krysa rodu rattus MeSH
• kyselina valproová terapeutické užití   MeSH
• léková rezistence MeSH
• lidé MeSH
• psychofarmakologie trendy   MeSH
• RNA dlouhá nekódující dějiny   genetika   MeSH
• schizofrenie genetika   patologie   terapie   MeSH
• synapse fyziologie   účinky léků   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• krysa rodu rattus MeSH
• lidé MeSH
• zvířata MeSH

Východiska: Poskytnout přehlednou informaci o významu dlouhých nekódujících RNA (lncRNA) v patogenezi karcinomu z renálních buněk (renal cell carcinoma – RCC) a možnostech jejich využití v diagnostice, stanovení prognózy onemocnění a predikci léčebné odpovědi. Materiál a metody: Vyhledávání v databázích PubMed a Web of Science s využitím variant klíčových slov "dlouhé nekódující RNA“ ("lncRNA“, "long noncoding RNA“, "long non-coding RNA“) a "karcinom z renálních buněk“ ("renal cancer“, "renal cell carcinoma“, "kidney cancer“). Separace výsledků týkajících se patogeneze, dia­gnózy, prognózy a využití jako terapeutických cílů. Výsledky: Dlouhé nekódující RNA regulují genovou expresi na všech úrovních. Uplatňují se jako onkogeny i jako nádorové supresory. Mechanizmus jejich působení je objasněn pouze částečně, v patogenezi renálního karcinomu však aktivně regulují kaskádu faktorů indukovaných hypoxií, epiteliálně-mezenchymální tranzici, buněčnou proliferaci, buněčný cyklus, apoptózu, lokální invazi a vznik metastáz. Aberantní exprese ve tkáni nádoru ve srovnání se zdravým renálním parenchymem a korelace expresních hladin s klinicko-patologickými charakteristikami tumoru umožňují potenciální využití mnoha lncRNA jako biomarkerů pro časnou detekci a stanovení prognózy onemocnění vč. odpovědi na cílenou léčbu. Testy in vitro naznačují potenciální využití lncRNA jako terapeutických cílů. Závěr: Poznatků o dlouhých nekódujících RNA ve vztahu ke karcinomu z renálních buněk rychlým tempem přibývá. V současné době lze některé z nich považovat za slibné biomarkery. Před uvedením do rutinní klinické praxe je potřeba dalšího výzkumu.

Background: To provide an overview of the importance of long non-coding RNAs (lncRNAs) in the pathogenesis of renal cell carcinoma and their utility as bio­markers for dia­gnosis, prognosis and prediction of treatment response. Materials and methods: A literature search in the Pubmed and Web of Science databases using the keywords variations of “long non-coding RNA” (“lncRNA”, “long noncoding RNA”, “long non-coding RNA”) and “renal cell carcinoma” (“renal cancer”, “renal cell carcinoma”, “kidney cancer”) was performed. The results related to the pathogenesis, dia­gnosis, prognosis and use as therapeutic targets were separated. Results: Long non-coding RNAs regulate gene expression at different levels. They act both as oncogenes and tumor suppressors. The mechanism of their action has not been fully elucidated, but they are actively involved in the regulation of hypoxia inducible factors pathway, epithelial-mesenchymal transition, cell proliferation, cell cycle regulation, apoptosis, local invasion and development of metastases. Aberrant expression in tumor tissue compared to healthy parenchyma and the correlation of expression levels with clinical-pathological features allow the potential use of many lncRNAs as bio­markers for early detection and prognosis of the disease, including the response to targeted therapy. In vitro assays indicate the potential use of lncRNAs as therapeutic targets. Conclusion: Our knowledge of long non-coding RNAs in relation to renal cell carcinoma is increasing rapidly. At present, some of them can be considered as promising bio­markers. Further research is needed before they can be introduced into routine clinical practice.

• MeSH
• karcinom z renálních buněk * diagnóza   MeSH
• lidé MeSH
• nádorové biomarkery * MeSH
• prognóza MeSH
• RNA dlouhá nekódující MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

• MeSH
• chřipka lidská diagnóza   mikrobiologie   MeSH
• fluorescenční protilátková technika MeSH
• lidé MeSH
• Orthomyxoviridae izolace a purifikace   MeSH
• RNA virová analýza   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• srovnávací studie MeSH