RNA sequencing
Dotaz
Zobrazit nápovědu
Závěrečná zpráva o řešení grantu Agentury pro zdravotnický výzkum MZ ČR
Nestr.
Dědičné neuropatie, včetně nejčastější formy Charcot-Marie-Tooth (CMT), jsou skupinou onemocnění, pro které je charakteristické distální postižení končetin - svalová slabost a deformity nohou i rukou, svalové atrofie. V naší laboratoři je díky dlouholeté diagnostice této skupiny chorob pro celou ČR shromážděn velký soubor pacientů. Máme vybráno několik velkých rodin (minimálně 4), u kterých příčina onemocnění doposud není známa, a to i po provedení vyšetření nejčastějších genových poruch spojených s CMT, genového mapovaní na SNP čipech, nejnovější metody masivně paralelního sekvenování vyšetřením panelů všech genů, které jsou v současnosti spojovány s CMT a celoexomového sekvenování. Cílem projektu je provedení dalších moderních analýz v těchto rodinách, a tím objasnění příčiny dědičné neuropatie. Využijeme zcela nové možnosti a metody a to celogenomové sekvenování a transkriptomové sekvenování. V první fázi se zaměříme na objasnění příčiny u čtyř velkých rodin, ve druhé fázi budou do projektu zahrnuty i další rodiny (celkem až 10 rodin).; Hereditary neuropathies (IPN) are a group of inherited peripheral neuropathies, which are characterized by distal muscle weakness, foot deformities and muscle atrophy. We have gathered a few families in whom the cause of the disease remained unknown – even after using a variety of methods like linkage analysis, targeted massively parallel sequencing of a gene panel and whole exome sequencing (WES). The aim of the project is to implement advanced analyses, clarify the causes of CMT disease in this group of patients with previously unexplained cause of hereditary neuropathy. We will use new possibilities and methods such as whole genome sequencing and RNA sequencing. Firstly, we will focus on four larger families, with clinically well documented inherited peripheral neuropathy and multiple affected members. Secondly, other families will also be included in the project (up to ten families).
- MeSH
- hereditární motorické a senzitivní neuropatie diagnóza genetika MeSH
- lidé MeSH
- sekvenční analýza RNA metody MeSH
- sekvenování celého genomu metody MeSH
- sekvenování transkriptomu MeSH
- vzácné nemoci diagnóza genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Konspekt
- Patologie. Klinická medicína
- NLK Obory
- genetika, lékařská genetika
- neurologie
- NLK Publikační typ
- závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR
Východiska: Nádorový genom dětských pacientů se vyznačuje řadou charakteristik, které jej značně odlišují od malignit dospělého věku. Mezi tyto charakteristiky patří nízká mutační nálož, významná role epigenetických změn a také četnost výskytu fúzních genů jakožto řídicích prvků kancerogeneze. Fúzní geny vznikají v důsledku několika typů chromozomálních přestaveb, jako jsou translokace, delece, inzerce či inverze, a mohou mít celou řadu funkčních dopadů. Ačkoli byly v minulosti studovány především v kontextu hematologických malignit, jejich význam v diagnostice a terapii solidních nádorů neustále narůstá. Materiál a metody: U 250 pacientů se solidními nádory z Kliniky dětské onkologie Fakultní nemocnice Brno byla provedena analýza fúzních genů metodou cíleného RNA sekvenování. Sekvenační knihovny byly připraveny s pomocí sady TruSight RNA Pan-Cancer Panel (Illumina, USA), který pokrývá 1385 klinicky relevantních genů. Sekvenace knihoven proběhla s využitím NextSeq Mid Output Kit (150 cyklů) na platformě NextSeq 500 (Illumina, USA). Sekvenační čtení byla namapována na referenční genom hg38 s pomocí STAR aligneru s parametry nastavenými tak, aby umožnily detekci fúzních genů. Pro vyhledání fúzních genů byly použity nástroje Arriba a STARfusion a identifikované fúzní geny byly manuálně ověřeny v softwaru IGV. Výsledky: Klinicky relevantní fúzní geny byly identifikovány u 25 % pacientů. Největší podíl identifikovaných fúzí tvořily fúze asociované se sarkomy, jako jsou EWSR1-FLI1, PAX3-FOXO1 nebo SS18-SSX1/2. Druhou největší skupinu představovaly fúze typické pro nádory CNS, zejména KIAA1549-BRAF či jiné fúze aktivující Ras/MAPK signalizaci. U pacientky s renálním karcinomem byla identifikována dosud nepopsaná fúze DVL3-TFE3. Celkem 33 % identifikovaných fúzních genů bylo terapeuticky cílitelných a u 2/3 pacientů s terapeuticky cílitelnou fúzí byla nasazena odpovídající léčba. Závěr: Analýza fúzních genů má velký přínos v diagnostice, prognostické stratifikaci a terapeutickém plánování pediatrických onkologických pacientů. Použití vysokokapacitních přístupů, jako je RNA sekvenování, umožňuje identifikaci nových fúzních genů a tím také hlubší porozumění komplexním změnám doprovázejícím vznik a rozvoj nádorových onemocnění.
Background: Pediatric cancer genome significantly differs from the genome of adult malignancies and is characterized by low tumor mutational burden, the great importance of epigenetic changes, and also the frequent occurrence of fusion genes. Fusion genes arise as a result of several types of chromosomal rearrangements, such as translocations, deletions, insertions, or inversions, and can have a variety of functional impacts. In the past, they were studied mainly in the context of hematological malignancies; however, their importance in the diagnostics and therapy of solid tumors is increasing. Materials and methods: In 250 patients with solid tumors from the Department of Pediatric Oncology of University Hospital Brno, an analysis of fusion genes was performed using targeted RNA sequencing. Sequencing libraries were prepared using the TruSight RNA Pan-Cancer Panel (Illumina), which covers 1 385 clinically relevant genes, and sequenced using the NextSeq Mid Output Kit (150 cycles) on the NextSeq 500 platform (Illumina). Sequencing reads were mapped to hg38 using the STAR aligner with parameters set to allow fusion genes detection. Arriba and STARfusion tools were used to search for fusion genes, which were subsequently manually verified in the IGV software. Results: Clinically relevant fusion genes were identified in 25% of patients. The largest proportion of fusions identified were fusions associated with sarcomas, such as EWSR1-FLI1, PAX3-FOXO1, or SS18-SSX1/2. The second-largest group was represented by CNS tumor fusions, especially KIAA1549-BRAF or other Ras/MAPK-associated fusions. A previously undescribed DVL3-TFE3 fusion was identified in a renal carcinoma patient. 33% of the identified fusion genes were therapeutically targetable, and 2/3 of patients received corresponding treatment. Conclusion: The analysis of fusion genes is of great benefit in the diagnostics, prognostic stratification, and therapeutic planning of pediatric cancer patients. The use of high-throughput approaches such as RNA sequencing enables the identification of novel fusion genes as well as a deeper understanding of the complex changes that are involved in the development of the disease.
... gels 90 -- Recovery of RNA from agarose gels 91 -- Use of sequencing to determine the size of RNA 92 ... ... -- Sequencing genes 92 -- Sequencing RNA 93 -- References 93 -- 4. ... ... Determination of RNA sequences 95 -- An overview of methods for determining RNA sequences 95 -- Methods ... ... fragments on polyacrylamide gels 115 -- Direct sequencing methods for RNA 116 -- Sequencing RNA using ... ... partial nuclease degradation 118 -- Sequencing RNA using the dideoxy chain termination method 119 -- ...
xi, 196 stran : ilustrace, tabulky ; 24 cm
Bylo zjištěno, že RNA interference je účinným nástrojem pro inhibici určité sekvence pro expresi genu. Tento děj využívá krátkou dvouvláknovou RNA, hlavně malou interferující RNA a krátkou nekódující RNA, zvanou mikroRNA. Tyto RNA zasahují do exprese genů tím, že je „utišují". Mechanismus RNA interference má obrovský potenciál stát se použitelným v boji proti různým nemocem.
RNA interference has been recognized to be an efficient mechanism for the sequence specific inhibition of gene-expression. This mechanism utilizes short double-stranded RNA, especially small-interfering RNA and short non-coding RNA called microRNA. These RNAs interfere with the expression of the genes in order to silence it. RNA interference mechanism has a great potential to be used as therapeutics against several disease.
This study describes the application of high-throughput sequencing of small RNA analysis of the efficacy of using Ribavirin to eliminate Grapevine leafroll-associated virus 1, Grapevine fleck virus and Grapevine rupestris stem pitting-associated virus from Vitis vinifera cv. Riesling. The original plant used for sanitation by Ribavirin treatment was one naturally infected with all the viruses mentioned above as confirmed by RT-PCR. A tissue cultures of the plant were established and plantlets obtained were sanitized using Ribavirin. Three years after sanitation, a small RNA sequencing method for virus detection, targeting 21, 22 and 24 nt-long viral small RNAs (vsRNAs), was used to analyze both the mother plant and the sanitized plants. The results showed that the mother plant was infected by the three mentioned viruses and additionally by two viroids - Hop stunt viroid and Grapevine yellow speckle viroid 1. After Ribavirin treatment, the plants contained only the two viroids, with the complete elimination of all the viruses previously present.
- MeSH
- nemoci rostlin prevence a kontrola virologie MeSH
- ribavirin farmakologie MeSH
- RNA virová genetika MeSH
- rostlinné viry účinky léků genetika MeSH
- sekvenční analýza DNA MeSH
- Vitis virologie MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování * MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Marine oomycetes have recently been shown to be concurrently infected by (-)ssRNA viruses of the order Bunyavirales. In this work, even higher virus variability was found in a single isolate of Phytophthora condilina, a recently described member of Phytophthora phylogenetic Clade 6a, which was isolated from brackish estuarine waters in southern Portugal. Using total and small RNA-seq the full RdRp of 13 different potential novel bunya-like viruses and two complete toti-like viruses were detected. All these viruses were successfully confirmed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using total RNA as template, but complementarily one of the toti-like and five of the bunya-like viruses were confirmed when dsRNA was purified for RT-PCR. In our study, total RNA-seq was by far more efficient for de novo assembling of the virus sequencing but small RNA-seq showed higher read numbers for most viruses. Two main populations of small RNAs (21 nts and 25 nts-long) were identified, which were in accordance with other Phytophthora species. To the best of our knowledge, this is the first study using small RNA sequencing to identify viruses in Phytophthora spp.
- MeSH
- fylogeneze MeSH
- genom virový MeSH
- malá nekódující RNA genetika MeSH
- otevřené čtecí rámce MeSH
- Phytophthora virologie MeSH
- RNA virová genetika MeSH
- RNA-viry klasifikace genetika izolace a purifikace MeSH
- sekvenční analýza DNA MeSH
- sekvenční analýza RNA * MeSH
- sekvenování transkriptomu MeSH
- virové nemoci virologie MeSH
- výpočetní biologie MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
- Geografické názvy
- Portugalsko MeSH
Celogenomové sekvenační analýzy odhalily, že převážná část lidského genomu je transkribována, a identifikovaly tisíce protein nekódujících transkriptů. Nekódující RNA (ncRNA) se dělí na dvě hlavní skupiny: malé a dlouhé ncRNA. Tento přehledový článek je zaměřen na ncRNA s regulační funkcí, a to především na mikroRNA a dlouhé ncRNA. Tyto ncRNA regulují genovou expresi na transkripční a posttranskripční úrovni. V tomto kontextu ncRNA zasahují do regulace většiny buněčných procesů a jejich deregulace má vážné dopady na fenotyp. Již stovky studií prokázaly zapojení ncRNA do patogeneze mnoha onemocnění, od metabolických poruch přes onemocnění orgánových systémů až po různé typy nádorů. Z klinického hlediska patří ncRNA do nové generace diagnostických a prognostických biomarkerů s velkým potenciálem. Vzhledem k vysoké tkáňové specifciitě a schopnosti regulovat více genů často v rámci jedné signální dráhy představují ncRNA i atraktivní terapeutické cíle. Narůstající poznatky o širokém spektru působení ncRNA ukazují na klíčovou roli těchto transkriptů v regulaci exprese. Řada aspektů z biologie ncRNA ještě není objasněna a jejich pochopení nám poskytne nový pohled na komplexnost regulační sítě.
Whole-genome sequencing analyses revealed that the majority of the human genome is transcribed and identified thousands of protein non-coding transcripts. Non-coding RNAs (ncRNAs) are divided into two main groups: small and long ncRNAs. This review is focused on the regulatory ncRNAs mainly on microRNAs and long ncRNAs. These ncRNAs regulate gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. In this context, ncRNAs are involved in the regulation of most cellular processes and their deregulation has serious impacts on the phenotype. Hundreds of studies have implicated ncRNAs in the pathogenesis of many diseases ranging from metabolic disorders to diseases of organ systems as well as various types of cancers. Clinically, ncRNAs belong to a new generation of diagnostic and prognostic biomarkers with a great potential. Due to high tissue specificity and ability to regulate multiple genes often within one signaling pathway, ncRNAs represent attractive therapeutic targets. Increasing knowledge about a wide spectrum of ncRNA actions demonstrate a pivotal role of these transcripts in expression regulation. Many aspects of the ncRNA biology are still unclear and their understanding will provide us a new perspective on the complexity of the regulatory network.
The mechanism of action of various viruses has been the primary focus of many studies. Yet, the data on RNA modifications in any type of virus are scarce. Methods for the sensitive analysis of RNA modifications have been developed only recently and they have not been applied to viruses. In particular, the RNA composition of HIV-1 virions has never been determined with sufficiently exact methods. Here, we reveal that the RNA of HIV-1 virions contains surprisingly high amount of the 1-methyladenosine. We are the first to use a liquid chromatography-mass spectrometry analysis (LC/MS) of virion RNA, which we combined with m1A profiling and deep sequencing. We found that m1A was present in the tRNA, but not in the genomic HIV-1 RNA and the abundant 7SL RNA. We were able to calculate that an HIV-1 virion contains per 2 copies of genomic RNA and 14 copies of 7SL RNA also 770 copies of tRNA, which is approximately 10 times more than thus far expected. These new insights into the composition of the HIV-1 virion can help in future studies to identify the role of nonprimer tRNAs in retroviruses. Moreover, we present a promising new tool for studying the compositions of virions.
- MeSH
- adenosin analogy a deriváty metabolismus MeSH
- chromatografie kapalinová metody MeSH
- genom virový genetika MeSH
- HIV-1 genetika fyziologie MeSH
- hmotnostní spektrometrie metody MeSH
- lidé MeSH
- nádorové buněčné linie MeSH
- RNA malá cytoplazmatická genetika MeSH
- RNA transferová genetika metabolismus MeSH
- RNA virová genetika metabolismus MeSH
- sekvence nukleotidů MeSH
- sestavení viru genetika MeSH
- signál-rozpoznávající částice genetika MeSH
- virion genetika metabolismus MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Biologická terapie, jejímž mechanizmem účinku je použití monoklonálních protilátek proti nějakému proteinu, je používána v klinické praxi již řadu let. V současné době ale vstupují do klinické praxe nové léky ze skupiny biologické terapie, které účinkují na principu RNA-interference. RNA-interference je proces, kterým buňky všech živých organizmů regulují expresi svých genů a při kterém může být zastaven přenos informace o syntéze konkrétního proteinu mezi DNA a ribosomy. Pro terapeutické účely se tohoto efektu dosahuje podáním umělých syntetizovaných oligonukleotidů s přesně danou sekvencí nukleosidů. Jde buď o krátké úseky dvouvláknové RNA, nebo o jednovláknové oligonukleotidy. Pro klinické využití byla nutná pro zvýšení jejich stability a odstranění některých nežádoucích účinků jejich chemická modifikace, a dále pak vazba na další substance, které umožní jejich cílený transport do požadované tkáně. Celá řada těchto léků je již v pokročilých fázích klinických studií a některé z nich vstupují na farmaceutický trh.
Biological therapy, whose mechanism of action is the use of monoclonal antibodies against a protein, has been used in clinical practice for many years. However, new drugs from the group of biological therapies that act on the principle of RNA interference are now entering clinical practice. RNA interference is the process by which cells in all living organisms regulate the expression of their genes, and in which the transfer of information about the synthesis of a particular protein between DNA and ribosomes can be stopped. For therapeutic purposes, this effect is achieved by administering artificially synthesized oligonucleotides – short chains of RNA with a precise nucleoside sequence. These are either short stretches of double- stranded RNA or single-stranded oligonucleotides. For clinical use, their chemical modification was necessary to increase their stability and remove some of their side effects, and then binding to other substances to allow their targeted transport to the desired tissue. A number of these drugs are already in advanced stages of clinical trials, and some are entering the pharmaceutical market.
Small RNA-sequencing (RNA-Seq) is being increasingly used for profiling of circulating microRNAs (miRNAs), a new group of promising biomarkers. Unfortunately, small RNA-Seq protocols are prone to biases limiting quantification accuracy, which motivated development of several novel methods. Here, we present comparison of all small RNA-Seq library preparation approaches that are commercially available for quantification of miRNAs in biofluids. Using synthetic and human plasma samples, we compared performance of traditional two-adaptor ligation protocols (Lexogen, Norgen), as well as methods using randomized adaptors (NEXTflex), polyadenylation (SMARTer), circularization (RealSeq), capture probes (EdgeSeq), or unique molecular identifiers (QIAseq). There was no single protocol outperforming others across all metrics. Limited overlap of measured miRNA profiles was documented between methods largely owing to protocol-specific biases. Methods designed to minimize bias largely differ in their performance, and contributing factors were identified. Usage of unique molecular identifiers has rather negligible effect and, if designed incorrectly, can even introduce spurious results. Together, these results identify strengths and weaknesses of all current methods and provide guidelines for applications of small RNA-Seq in biomarker research.
