V této prospektivní studii shrnujeme naše první zkušenosti s neinvazivní prenatální RHc genotypizací plodu s využitím PCR v reálném čase, specifických primerů a TaqMan sondy navržených pro c alelu RHCE genu. Celkem bylo testováno 13 nealoimunizovaných a 1 anti-c aloimunizovaných těhotných žen v rozmezí 12. až 33. týdne gravidity. Výsledky neinvazivní prenatální RHc genotypizace plodu provedené na DNA extrahované z periferní krve matek jsme korelovali s výsledky imunohematologické analýzy pupečníkové krve. Výsledky RHc genotypizace plodu byly ve shodě s vyšetřením pupečníku u všech vyšetřených těhotných žen. Neinvazivní prenatální RHc genotypizace plodu umožňuje identifikaci plodů v riziku hemolytického onemocnění. Detekce Rhc negativních plodů u anti-c aloimunizovaných těhotenství může vyloučit potřebu invazivního prenatálního vyšetření.
In this prospective study, we described our first experience with non-invasive foetal RHc genotyping by analysis of DNA extracted from maternal plasma samples by using real-time PCR, specific primers and TaqMan probe targeted toward c allele of RHCE gene. We analysed 13 non-alloimmunised and 1 anti-c alloimmunised pregnant woman within 12th and 33rd week of pregnancy and correlated the results with serological analysis of cord blood. Non-invasive prenatal foetal RHc genotyping analysis of maternal plasma samples was in complete concordance with the analysis of cord blood in all pregnancies. Non-invasive foetal RHc genotyping enables the identification of foetuses at risk of haemolytic disease of the newborn. An identification of RHc negative foetuses in anti-c alloimmunized pregnancies may exclude the demand of invasive prenatal procedures.
Vtéto prospektivní studii shrnujeme naše zkušenosti se zavedenímnové neinvazivnímetody prenatálníRHD, RHC a RHE genotypizace plodu z periferní krve RhD negativních těhotných žen s využitím PCRv reálném čase a specifických primerů a TaqMan sond navržených pro RHD a RHCE geny. Celkem bylotestováno 29 RhD negativních těhotných žen v rozmezí 14. a 40. týdne gravidity.Výsledky neinvazivníprenatální RHD, RHC a RHE genotypizace plodu provedené na DNA extrahované z periferní krvematek jsme korelovali s výsledky imunohematologické analýzy pupečníkové krve po porodu dítěte.Výsledky genotypizace plodu v oblasti exonu 7 a exonu 10 RHD genu byly ve shodě s vyšetřenímpupečníku u 29 z 29 RhD negativních těhotných žen, které porodily 13 RhD pozitivních a 16 RhDnegativních dětí. RHC genotypizace plodu v oblasti exonu 2 byla správně provedena u 25 z 25 Rhchomozygotních těhotných žen, z toho 8 žen porodilo RhC pozitivní a 17 RhC negativní děti. RHEgenotypizace plodu byla rovněž správně provedena u 29 z 29 Rhe homozygotních těhotných žen, z toho5 žen porodilo RhE pozitivní a 24 RhE negativní děti. RHC a RHE genotypizace plodu je velmi cennázejména v případě identifikace RhD negativního plodu vzhledem k amplifikaci další paternálně zděděnéalely, jež je průkazem přítomnosti fetálníDNAvmateřské cirkulaci.Doporučujeme proto provádětsimultánní RHD, RHC a RHE genotypizaci plodu u RhD negativních aloimunizovaných těhotenství veII. nebo III. trimestru gravidity za předpokladu, že matka nese příslušný Rh fenotyp (ccee, ccEe, Ccee).
In this prospective study,we assessed the feasibility of foetalRHD,RHCandRHEgenotyping by analysisof DNA extracted from maternal plasma samples collected from RhD negative pregnant women usingRQ-PCR and primers and probes targeted toward RHD and RHCE genes.We analysed 29 RhD negativepregnant women within 14th and 40th week of pregnancy and correlated the results with serologicalanalysis of cord blood after the delivery. Non-invasive prenatal foetal RHD exon 7 and exon 10genotyping analysis of maternal plasma samples was in complete concordance with the analysis of cordblood in 29 out of 29 RhD negative pregnant women delivering 13 RhD positive and 16 RhD negativenewborns. Non-invasive prenatal foetal RHC exon 2 genotyping was well performed in 25 out of 25 Rhchomozygote pregnant women delivering 8 RhC positive and 17 RhC negative newborns. Similarlynon-invasive prenatal foetal RHE genotyping was well done in 29 out of 29 Rhe homozygote pregnantwomen delivering 5 RhE positive and 24 RhE negative newborns. Foetal RHC and RHE genotyping inRhD negative pregnancies is very valuable, since in case of identification of RhD negative fetussimultaneous amplification of another paternally inherited allele (RhC or RhE positivity) proves thepresence of foetal DNA in maternal circulation. We recommend to perform simultaneous foetal RHD,RHC and RHE genotyping in alloimunised RhD negative pregnancies with certain phenotypes (ccee,ccEe, Ccee).
- MeSH
- Adult MeSH
- Phenotype MeSH
- Research Support as Topic MeSH
- Genotype MeSH
- Pregnancy Complications, Hematologic diagnosis therapy MeSH
- Humans MeSH
- Fetal Diseases diagnosis genetics MeSH
- Polymerase Chain Reaction MeSH
- Prenatal Diagnosis methods MeSH
- Rho(D) Immune Globulin genetics MeSH
- Pregnancy MeSH
- Check Tag
- Adult MeSH
- Humans MeSH
- Pregnancy MeSH
- Female MeSH
- Publication type
- Review MeSH
- Comparative Study MeSH
V této prospektivní studii shrnujeme naše zkušenosti se zavedením nové neinvazivní metody prenatálnídiagnostiky RHD genotypizace plodu z periferní krve těhotných žen s využitím PCR v reálném časea specifických primerů a TaqMan sond pro exon 7 a exon 10 RHD genu. Celkem jsme analyzovali 46vzorků od 39 RhD negativních těhotných žen (z toho 5 aloimunizovaných: 1x anti-D, 2x anti-D a anti-Ca 2x přítomnost nespecifických protilátek v enzymatickém testu). Výsledky neinvazivní prenatálníRHD genotypizace plodu provedené na DNA extrahované z periferní krve matek jsme korelovalis výsledky imunohematologické analýzy pupečníkové krve po porodu dítěte. Výsledky genotypizaceplodu v oblasti exonu 7 RHD genu byly ve shodě s vyšetřením pupečníku u všech těhotných žen, kterédoposud porodily (n = 20, z toho 12 RhD pozitivních a 8 RhD negativních dětí). V případě genotypizaceplodu v oblasti exonu 10 RHD genu jsme nedetekovali RhD pozitivitu plodu u 10 z 12 těhotenství.Předpokládáme, že tyto dva falešně negativní výsledky mohly být způsobeny částečnou delecí neboaberacemi RHD genu v 3´ netranslatované oblasti exonu 10, kde se specifické primery a TaqMan sondaváží k cílové DNA. Specificita metody pro oba RHD (exon 7 a exon 10) RQ-PCR systémy dosáhla 100 %,jelikož jsme v periferní krvi těhotných žen, které porodilyRhDnegativní děti (n = 8),nedetekovali žádnéRHD pozitivní amplifikační signály. Neinvazivní predikce RhD statutu plodu je rychlá a spolehliváa může být zahrnuta do rutinních vyšetření prenatální diagnostiky. Pro spolehlivou diagnostiku všakdoporučujeme, aby byla vždy prováděna amplifikace alespoň dvou různých oblastí RHD genu. NeinvazivníprenatálníRHD genotypizace plodu umožňuje identifikaci plodů v riziku hemolytického onemocnění.Doporučujeme, aby byl v průběhu těhotenství u každé RhD negativní ženy vyšetřen neinvazivněRHD genotyp plodu, nejlépe v I. nebo II. trimestru, a to i u nesenzibilizovaných těhotenství, kterých jevětšina.
In this prospective study, we assessed the feasibility of fetal RHD genotyping by analysis of DNAextracted from maternal plasma samples collected from RhD negative pregnant women using RQ-PCRand primers and probes targeted toward exon 7 and exon 10 of RHD gene.We analysed 46 samples from39 RhD negative pregnant women including 5 sensitised (1x anti-D, 2x anti-D and anti-C, 2x non-specificantibodies in enzymatic assay) and correlated the results with serological analysis of cord blood afterthe delivery. Non-invasive prenatal fetal RHD exon 7 genotyping analysis of maternal plasma sampleswas in complete concordance with the analysis of cord blood in all 20 RhD negative pregnant womendelivering 12RhDpositive and8RhDnegativenewbornsuntilnow.RHDexon 10 specificPCRampliconswere not detected in 2 out of 12 studied plasma samples from women bearing RhDpositive fetus, despitethe positive amplification in RHD exon 7 region observed in all cases. We supposed that false negativeresults might be caused by a partly deletion or aberrant structure of the 3´ untranslated exon 10 regionof RHD gene where specific primers and probe should anneal. The specificity of both RHD exon 7 andexon 10 systems approached 100% since no RHD positive signals were detected in women currentlypregnant with RhD negative fetus (n = 8). Prediction of fetal Rhesus D status from maternal plasma ishighly accurate and enables implementation into clinical routine. We suggest that safe non-invasiveprenatal fetal RHD genotyping using maternal plasma should involve the amplification of at least twoRHD specific products. Fetal RHD genotyping may allow the identification of fetuses at risk ofhaemolytic disease of newborn. However,we suggest to apply a non-invasive prenatal RHD genotyping assay in the routine testing of allRhDnegativewomen involving both sensitised as well as nonsensitizedpregnancies, which is the majority.
- MeSH
- DNA blood MeSH
- Adult MeSH
- Research Support as Topic MeSH
- Genotype methods MeSH
- Humans MeSH
- Fetal Diseases diagnosis genetics MeSH
- Polymerase Chain Reaction methods MeSH
- Prospective Studies MeSH
- Rho(D) Immune Globulin genetics blood MeSH
- Pregnancy MeSH
- Check Tag
- Adult MeSH
- Humans MeSH
- Pregnancy MeSH
- Female MeSH
- Publication type
- Review MeSH
- Comparative Study MeSH
Cíl studie: Doposud používaný ABI PRISM 7700 sekvenční detekční systém se již přestal vyrábět, řada laboratoří je proto nucena převést dosavadní neinvazivní prenatální diagnostiku na nové přístrojové vybavení. V této studii se zaměřujeme na testování použití 7300 real-time PCR systému pro účely rutinního neinvazivního určení pohlaví, RHD a RHCE genotypu plodu. Název a sídlo pracoviště: Laboratoř buněčné biologie, Pediatrická klinika, 2. LF UK a FN Motol Praha. Materiál a metody: Hodnotíme amplifikaci paternálních alel na extracelulární DNA izolované z mateřské periferní krve pomocí QIAamp DSP Virus kitu (c a E alely RHCE genu) a QIAamp DNA Blood Mini kitu (SRY, RHD a C alela RHCE genů) u 22 těhotných žen v rozmezí 10.–38. týdne gravidity. Výsledky: SRY (n = 6), RHD (exon 7 a exon 10, n = 7) a RHCE (C alela, n = 3; c alela, n = 3; E alela, n = 3) genotypizace plodu provedené na 7300 real-time PCR systému byly ve shodě s pohlavím a Rh fenotypem plodu či narozeného dítěte u všech vyšetřených těhotných žen. Závěr: Prokázali jsme, že 7300 real-time PCR systém je dostatečně citlivý pro detekci paternálních alel na fetální DNA přítomné v extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy. Tímto způsobem můžeme nadále i po vyřazení ABI PRISM 7700 sekvenčního detekčního systému z provozu zajišťovat spolehlivé neinvazivní určení pohlaví plodu u těhotenství s rizikem X-vázaných onemocnění u plodu a neinvazivní RHD a RHCE genotypizaci plodu u aloimunizovaných těhotenství s rizikem fetální erytroblastózy.
Objective: Since ABI PRISM 7700 sequence detection system has not already been commercially available, quite a number of laboratories are obliged to perform actual non-invasive prenatal diagnosis from maternal peripheral blood on new equipment. The purpose of this study was to test the usage of 7300 real-time PCR system for the purpose of routine non-invasive fetal sex determination and fetal RHD and RHCE genotyping. Settings: Cell Biology Laboratory, Paediatric Clinic, 2nd Medical Faculty and University Hospital Motol Prague. Material and Methods: We evaluated paternal allele amplification on extracellular DNA isolated from maternal peripheral blood by using QIAamp DSP Virus kit (c and E alleles of RHCE gene) and QIAamp DNA Blood Mini kit (SRY, RHD and C allele of RHCE gene) in a cohort of 22 pregnant women within 10th and 38th week of pregnancy. Results: The results of fetal SRY (n = 6), RHD (exon 7 and exon 10, n = 7) and RHCE (C allele, n = 3; c allele, n = 3; E allele, n = 3) genotyping performed on 7300 real-time PCR system corresponded to sex and/or Rh phenotype of the foetus or the newborn in all tested pregnant women. We showed that 7300 real-time PCR system is sensitive enough for paternal allele detection performed on fetal DNA fraction within extracellular DNA isolated from maternal plasma. Conclusion: After ABI PRISM 7700 sequence detection system would be completely taken out of service, we would be able henceforth to provide reliable non-invasive fetal sex determination in pregnancies at risk of X-linked disorders and non-invasive fetal RHD and RHCE genotyping in alloimmunized pregnancies at risk of haemolytic disease of newborn.
- MeSH
- Gene Amplification physiology genetics MeSH
- Research Support as Topic MeSH
- Genes, sry physiology genetics MeSH
- Humans MeSH
- Polymerase Chain Reaction methods trends utilization MeSH
- Sex Determination Processes MeSH
- Sequence Analysis, DNA methods utilization MeSH
- Pregnancy genetics blood MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
- Pregnancy genetics blood MeSH
Provedli jsme modifikaci a optimalizaci postupů pro izolaci extracelulární DNA z mateřské cirkulace pro neinvazivní určení pohlaví plodu u těhotenství s rizikem X-vázaných onemocnění u plodu a pro neinvazivní RHD a RHCE genotypizaci plodu u aloimunizovaných těhotenství s rizikem hemolytického onemocnění plodu. V této studii srovnáváme výsledky amplifikace SRY, RHD a RHCE genu na extracelulární DNA izolované z mateřské periferní krve pomocí QIAamp DSP Virus kitu a QIAamp DNA Blood Mini kitu. Výsledky našich analýz prokázaly, že QIAamp DSP Virus kit zvyšuje výtěžnost extracelulární fetální DNA přítomné v mateřské plazmě, což je klíčové zejména u amplifikace paternálně zděděných alel, které se liší od alel maternálních pouze v jednom nukleotidu. Doporučujeme proto provádět detekci paternální Rhc alely a RhE alely RHCE genu na extracelulární DNA izolované z mateřké plazmy pouze pomocí QIAamp DSP Virus kitu. Pro amplifikaci SRY a RHD genu dostačuje extracelulární DNA extrahovaná z mateřské plazmy prostřednictvím QIAamp DNA Blood Mini kitu. V případě sporných výsledků, tj. při nálezu pozdních amplifikačních cyklů (po 40. cyklu), doporučujeme rovněž provedení PCR analýzy na extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy pomocí QIAamp DSP Virus kitu. Spolehlivá detekce plodů negativních na aglutinogeny, vůči nimž je matka aloimunizována, vylučuje riziko fetální erytroblastózy. Spolehlivá detekce plodů ženského pohlaví u těhotenství s rizikem X-vázaných onemocnění může vyloučit potřebu invazivního prenatálního vyšetření.
We carried out the modification and optimalisation of extracellular fetal DNA isolation from maternal circulation for non-invasive fetal sex determination in pregnancies at risk of X-linked disorders and for non-invasive fetal RHD and RHCE genotyping in alloimmunized pregnancies at risk of haemolytic disease of newborn. In this study, we compared the results of fetal SRY, RHD and RHCE genotyping by analysis of DNA extracted from maternal plasma samples by using QIAamp DSP Virus kit and QIAamp DNA Blood Mini kit. We showed that QIAamp DSP Virus kit enhanced the recovery of extracellular fetal DNA from maternal plasma that is crucial especially for the detection of those paternally-inherited alleles that differ from maternal alleles only in one nucleotide. Therefore we recommend to perform the detection of fetal Rhc allele and RhE allele of RHCE gene by analysis of extracellular DNA extracted from maternal plasma samples by using QIAamp DSP Virus kit only. We showed that the use of extracellular DNA extracted from maternal plasma samples by using QIAamp DNA Blood Mini kit is sufficient for non-invasive fetal SRY and RHD genotyping. In case of controversial results due to the late amplification (Ct ≥ 40) we recommend to perform real-time PCR analysis on extracellular DNA extracted from maternal plasma samples by using QIAamp DSP Virus kit. Reliable non-invasive detection of negative foetuses in alloimmunized pregnancies may exclude the risk of haemolytic disease of newborn. Reliable non-invasive detection of female foetuses in pregnancies at risk of X-linked disorders may exclude the performance of invasive prenatal diagnostic procedures.
- MeSH
- Sex Determination Analysis methods MeSH
- Research Support as Topic MeSH
- Genetic Diseases, X-Linked prevention & control MeSH
- Erythroblastosis, Fetal prevention & control MeSH
- Humans MeSH
- Blood Specimen Collection utilization MeSH
- Prenatal Diagnosis methods MeSH
- Reagent Kits, Diagnostic utilization MeSH
- Sequence Analysis, DNA MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
- Publication type
- Evaluation Study MeSH
Terapeutické monitorování hladin léčiv je specifická metoda klinické farmakologie pro monitorování terapie pomocí měření koncentrace léčiva v séru s následnou interpretací a akceptací klinikem. Je významným pomocníkem pro personalizovanou medicínu v oblasti individualizace dávkování, poněvadž umožňuje racionální terapii s minimalizací výskytu nežádoucích účinků, snížení mortality a morbidity a snížení nákladů. Fenotypizace a genotypizace mohou posunout terapeutické monitorování léčiv na vyšší kvalitativní úroveň.
Therapeutic drug monitoring is a specific method of clinical pharmacology for monitoring of the therapy using measurement of drug serum concentrations followed by interpretation and good cooperation with clinician. It significantly helps to personalize and rationalize the treatment, to set individualized dosing, to minimize side effects, to decrease mortality and morbidity and to decrease the costs. Phenotyping and genotyping can increase therapeutic drug monitoring on higher level.
- Keywords
- terapeutické monitorování, individualizace a personalizace dávkování léčiv,
- MeSH
- Pharmacokinetics MeSH
- Phenotype MeSH
- Genotype MeSH
- Precision Medicine MeSH
- Humans MeSH
- Drug Monitoring MeSH
- Drug Dosage Calculations MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
- Publication type
- Review MeSH
