• Klíčová slova
• DNA, Laboratorní technika,
• MeSH
• klinické laboratorní techniky MeSH
• proteinové inženýrství MeSH
• rekombinantní DNA MeSH
• Publikační typ
• laboratorní příručky MeSH

• Konspekt
• Biotechnologie. Genetické inženýrství
• NLK Obory
• biomedicínské inženýrství

Expresní systém kvasinky Pichia pastoris se ve velkém měřítku používá na produkci rekombinantních proteinů již několik desetiletí. Pichia pastoris v sobě spojuje výhody eukaryotních i prokaryotních expresních systému. V rámci této práce byly v bioreaktoru produkovány mutantní formy proteinu cryptogeinu. Bylo vyprodukováno a purifikováno pět proteinů: X24, L41F, V84F, V84F/L41F a K13V s průměrnými výtěžky 40-60 mg proteinu na litr bazálního media. Buněčné hustoty na konci fermentace dosahovali 250-400 g/l.

Expression system Pichia pastoris has been used for decades to production of recombinant proteins in large scale. Pichia pastoris combines the advantages of eukaryotic and prokaryotic expression systems. In this work mutant forms of protein cryptogein were produced in the fermenter. Five proteins: X24, L41F, V84F, V84F/L41F and K13V were produced in the bioreactor and purified with average yields of 40-60 mg protein per liter of basal media. Cell density was reached 250-400 g/l at the end of fermentation.

• Klíčová slova
• růstová křivka, fermentor,
• MeSH
• bioreaktory MeSH
• fermentace * fyziologie   genetika   MeSH
• fungální proteiny * biosyntéza   genetika   MeSH
• kultivační média * MeSH
• mikrobiologické techniky MeSH
• Pichia genetika   metabolismus   růst a vývoj   MeSH
• proteomika * metody   MeSH
• rekombinantní proteiny * biosyntéza   genetika   MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Východisko. Bylo prokázáno, že nadměrná exprese proteinu HER-2/neu je důležitým prognostickýma prediktivním faktorem u invazivního karcinomu mléčné žlázy. U pacientek se zvýšenou expresí onkoproteinu HER-2/neu je v mnoha případech účinná léčba preparátem trastuzumab/Herceptin™, monoklonální protilátkou proti extracelulární doméně proteinu HER-2/neu, která vazbou na onkoprotein znemožní jeho aktivaci. Možnost léčby pacientek s karcinomem prsu Herceptinem zvyšuje nároky na přesné stanovení HER-2/neu ve tkáni. Biologický význam nadměrné exprese HER-2/neu proteinu a amplifikace genu HER-2/neu je v souvislosti s prognózou karcinomu stále předmětem studií. Metody a výsledky. Proto jsme vyšetřili náš soubor 449 karcinomů mléčné žlázy imunohistochemicky na expresi HER-2/neu onkoproteinu a molekulárně-geneticky pomocí fluorescenční in situ hybridizace s cílem prokázat amplifikaci genu HER-2/neu. Výsledky jsme porovnali s gradem karcinomu, se stavem hormonálních receptorů a s proliferační aktivitou stanovenou detekcí Ki67 antigenu. Všech 7 případů karcinomů se silnou overexpresí HER-2/neu (skóre 3+) vykazovalo amplifikaci genu. Naproti tomu skupina 11 karcinomů se slabou overexpresí (skóre 2+) byla heterogenní a amplifikaci jsme prokázali u 5 karcinomů (45 %). Závěry. Imunohistochemická detekce proteinu a molekulárně genetický průkaz amplifikace genu HER-2/neu jsou metody komplementární, přičemž imunohistochemie slouží jako metoda skríninková a fluorescenční in situ hybridizaci je třeba považovat za metodu konfirmační před vlastní terapií Herceptinem.

Background. HER-2/neu protein overexpression has been shown to be an independently adverse prognostic and predictive factor in patients with breast cancer. Recently, HER-2/neu overexpression has gained therapeutic implications: It has been shown that in patients with breast cancer the use of trastuzumab/HerceptinTM, the recombinant humanized monoclonal antibody directed against extracellular domain of HER-2/neu molecule, can block the HER-2/neu protein activation and bring about a clinical remission. Following these developments, demand for pathologists to evaluating properly HER-2/neu in breast cancer specimens has been rapidly increasing. Methods and Results. In our series of 449 cases of breast cancer, HER-2/neu protein and gene were examined by means of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization respectively. Results of HER-2/neu study were compared with the hormonal status, cancer grade and proliferation activity as assessed using immunohistochemistry with MIB1 antibody. All seven cases of breast cancer with strong overexpression of HER-2/neu (score 3+) manifested a gene amplification. In contrast, among 11 cases of breast cancers with mild HER-2/neu overexpression (score 2+), the gene amplification was demonstrated in 5 cases only (45 %). Conclusions. Immunohistochemical assessment and fluorescence in situ hybridization (FISH) are complementary methods for detection of HER-2/neu status in breast cancer. While immunohistochemistry is an excellent screening method, FISH should be used for the confirmation of positive results before the Herceptin treatment.

• MeSH
• exprese genu MeSH
• hybridizace in situ fluorescenční MeSH
• imunohistochemie metody   MeSH
• karcinom diagnóza   patologie   MeSH
• lidé MeSH
• monoklonální protilátky terapeutické užití   MeSH
• nádory prsu diagnóza   farmakoterapie   patologie   MeSH
• receptor erbB-2 krev   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

• MeSH
• exprese genu MeSH
• rekombinace genetická metody   MeSH
• rekombinantní proteiny MeSH
• techniky in vitro MeSH
• virus hepatitidy B MeSH
• virus vakcinie MeSH

With the growing availability of genomic sequence information, there is an increasing need for gene function analysis. Antibody-mediated "silencing" represents an intriguing alternative for the precise inhibition of a particular function of biomolecules. Here, we describe a method for selecting recombinant antibodies with a specific purpose in mind, which is to inhibit intrinsic protein-protein interactions in the cytosol of plant cells. Experimental procedures were designed for conveniently evaluating desired properties of recombinant antibodies in consecutive steps. Our selection method was successfully used to develop a recombinant antibody inhibiting the interaction of ARABIDOPSIS HISTIDINE PHOSPHOTRANSFER PROTEIN 3 with such of its upstream interaction partners as the receiver domain of CYTOKININ INDEPENDENT HISTIDINE KINASE 1. The specific down-regulation of the cytokinin signaling pathway in vivo demonstrates the validity of our approach. This selection method can serve as a prototype for developing unique recombinant antibodies able to interfere with virtually any biomolecule in the living cell.

• MeSH
• Arabidopsis genetika   MeSH
• cytosol imunologie   metabolismus   MeSH
• fosfotransferasy biosyntéza   genetika   imunologie   MeSH
• mapy interakcí proteinů genetika   imunologie   MeSH
• proteinkinasy biosyntéza   genetika   imunologie   MeSH
• proteiny huseníčku biosyntéza   genetika   imunologie   MeSH
• protilátky aplikace a dávkování   imunologie   MeSH
• regulace genové exprese u rostlin MeSH
• rekombinantní proteiny aplikace a dávkování   imunologie   MeSH
• signální transdukce MeSH
• umlčování genů imunologie   MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

• MeSH
• antigeny fungální biosyntéza   imunologie   MeSH
• proteiny teplotního šoku biosyntéza   imunologie   MeSH
• rekombinantní proteiny biosyntéza   imunologie   MeSH
• Trichophyton MeSH

Metody exprese a purifikace rekombinantních proteinů umožňují produkci a detailní charakterizaci proteinů v základním výzkumu během in vitro experimentů, ale také přípravu proteinů s terapeutickým využitím. Publikace shrnuje základní postupy od přípravy expresních vektorů až po techniku afinitní purifikace. Dále pojednává o vlastnostech různých prokaryotických a eukaryotických expresních systémů a možnostech jejich využití. Molekulární klonování, které slouží k přípravě expresních vektorů pro rekombinantní proteiny, umožňuje cíleně modifikovat vlastnosti těchto proteinů tak, aby byla usnadněna jejich purifikace a také pozměněna jejich stabilita, aktivita nebo funkce. V současné době je k dispozici široká škála metodických přístupů, jež umožňují rychlou a efektivní přípravu expresních vektorů. Zvolený produkční organizmus a způsob purifikace rekombinantního proteinu určují výběr expresního vektoru. První volbou často bývá expresní systém využívající bakterii Escherichia coli, jehož přednostmi jsou zejména technická, časová i finanční nenáročnost. Tento expresní systém není příliš vhodný pro produkci komplexních savčích proteinů, pro které jsou optimální expresní systémy založené na využití eukaryotických organizmů (kvasinky, hmyzí buňky nebo savčí buňky). Kultivace hmyzích a savčích buněk je však technicky i finančně náročná. Rekombinantní proteiny jsou purifikovány nejčastěji metodou afinitní chromatografie využívající specifickou interakci peptidu nebo proteinu s afinitní matricí. Tyto peptidy či proteiny jsou fúzovány s N‑ nebo C‑koncem purifikovaného proteinu. Purifikace probíhá ve třech krocích, kdy je rekombinantní protein prostřednictvím afinitních značek specificky zachycen na matrici chromatografické kolony, dále následuje promývací krok, po kterém je uvolněn z kolony čistý protein.

Production of recombinant proteins is essential for many applications in both basic research and also in medicine, where recombinant proteins are used as pharmaceuticals. This review sum­marizes procedures involved in recombinant protein expression and purification, including molecular cloning of target genes into expression vectors, selection of the appropriate expres­sion system, and protein purification techniques. Recombinant DNA technology allows protein engineering to modify protein stability, activity and function or to facilitate protein purification by affinity tag fusions. A wide range of cloning systems enabling fast and effective design of expression vectors is currently available. A first choice of protein expression system is usually the bacteria Escherichia coli. The main advantages of this prokaryotic expression system are low cost and simplicity; on the other hand this system is often unsuitable for production of complex mam­malian proteins. Protein expression mediated by eukaryotic cells (yeast, insect and mammalian cells) usually produces properly folded and posttranslationally modified proteins. How­ever, cultivation of insect and, especially, mammalian cells is time consuming and expensive. Affinity tagged recombinant proteins are purified efficiently using affinity chromatography. An affinity tag is a protein or peptide that mediates specific binding to a chromatography column, unbound proteins are removed during a washing step and pure protein is subsequently eluted. Key words: recombinant protein – molecular cloning – purification – expression system This work was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) and by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for bio­medical papers. Submitted: 22. 1. 2014 Accepted: 20. 3. 2014

• Klíčová slova
• purifikace, expresní systém, expresní vektor,
• MeSH
• chromatografie afinitní MeSH
• Escherichia coli genetika   MeSH
• eukaryotické buňky MeSH
• exprese genu * MeSH
• genetická transkripce MeSH
• genetické vektory * MeSH
• klonování DNA * MeSH
• kultivační média MeSH
• kvasinky genetika   MeSH
• prokaryotické buňky MeSH
• proteinové inženýrství MeSH
• rekombinantní proteiny * genetika   chemická syntéza   MeSH
• virové proteiny genetika   MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Affinity purification is a useful approach for purification of recombinant proteins. Eukaryotic expression systems have become more frequently used at the expense of prokaryotic systems since they afford recombinant eukaryotic proteins with post-translational modifications similar or identical to the native ones. Here, we present a one-step affinity purification set-up suitable for the purification of secreted proteins. The set-up is based on the interaction between biotin and mutated streptavidin. Drosophila Schneider 2 cells are chosen as the expression host, and a biotin acceptor peptide is used as an affinity tag. This tag is biotinylated by Escherichia coli biotin-protein ligase in vivo. We determined that localization of the ligase within the ER led to the most effective in vivo biotinylation of the secreted proteins. We optimized a protocol for large-scale expression and purification of AviTEV-tagged recombinant human glutamate carboxypeptidase II (Avi-GCPII) with milligram yields per liter of culture. We also determined the 3D structure of Avi-GCPII by X-ray crystallography and compared the enzymatic characteristics of the protein to those of its non-tagged variant. These experiments confirmed that AviTEV tag does not affect the biophysical properties of its fused partner. Purification approach, developed here, provides not only a sufficient amount of highly homogenous protein but also specifically and effectively biotinylates a target protein and thus enables its subsequent visualization or immobilization.

• MeSH
• antigeny povrchové chemie   genetika   izolace a purifikace   metabolismus   MeSH
• biotin chemie   metabolismus   MeSH
• biotinylace MeSH
• buněčné linie MeSH
• Drosophila cytologie   MeSH
• Escherichia coli enzymologie   genetika   MeSH
• exprese genu MeSH
• glutamátkarboxypeptidasa II chemie   genetika   izolace a purifikace   metabolismus   MeSH
• krystalografie rentgenová MeSH
• lidé MeSH
• molekulární modely MeSH
• molekulární sekvence - údaje MeSH
• rekombinantní proteiny chemie   genetika   izolace a purifikace   metabolismus   MeSH
• sekvence aminokyselin MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• Research Support, N.I.H., Intramural MeSH
• Research Support, U.S. Gov't, Non-P.H.S. MeSH

Rekombinantní protilátky jsou nejrychleji se rozvíjející třídou terapeutických proteinů, mimo to hrají klíčovou roli ve výzkumu a diagnostice. Z důvodu rostoucího zájmu o rekombinantní protilátky dochází k rozvoji různých produkčních systémů zahrnujících bakterie, kvasinky, hmyzí buňky a savčí buněčné linie. V současné době jsou rekombinantní protilátky, které jsou určené k terapeutickým účelům, produkovány výhradně savčími buněčnými liniemi z důvodu minimalizace rizika imunogenicity, která je u ostatních produkčních systémů způsobena nesprávnou posttranslační modifikací, zejména glykosylací. Nicméně pro účely in vitro diagnostiky je „správná” posttranslační modifikace protilátek nepodstatná a tyto protilátky mohou být produkovány v ostatních expresních systémech. V článku jsou popsány různé expresní systémy pro produkci rekombinantních protilátek s ohledem na jejich výhody a omezení.

Recombinant antibodies are the fastest growing class of therapeutic proteins, besides that they play a key role in research and diagnostics. Various production systems including bacteria, yeast, insect cells and mammalian cell lines are being developed due to a growing interest in recombinant antibodies. Recombinant antibodies, which are intended for therapeutic purposes, are currently exclusively produced in mammalian cell lines to ensure minimal risk of immunogenicity caused by non-human posttranslational modifications, in particular glycosylation. However, the „correct“ posttranslational modification of antibodies is irrelevant for in vitro diagnostic purposes. These antibodies can be produced in other expression systems. The article describes the different expression systems for production of recombinant antibodies with respect to their advantages and limitations.

• MeSH
• klonování DNA metody   MeSH
• protilátky * genetika   imunologie   metabolismus   terapeutické užití   MeSH
• rekombinantní proteiny * genetika   imunologie   metabolismus   terapeutické užití   MeSH

West Nile virus (WNV) is transmitted to humans and animals by a mosquito and enters the central nervous system, leading to lethal encephalitis. Reporter viruses expressing fluorescent proteins enable detection of infected cells in vitro and in vivo, facilitating evaluation of the dynamics of viral infection, and the development of diagnostic or therapeutic methods. In this study, we developed a method for production of a recombinant replication-competent WNV expressing mCherry fluorescent protein. The expression of mCherry was observed in viral antigen-positive cells in vitro and in vivo, but the growth of the reporter WNV was reduced as compared to the parental WNV. The expression of mCherry was stable during 5 passages in reporter WNV-infected culture cells. Neurological symptoms were observed in mice inoculated intracranially with the reporter WNV. The reporter WNV expressing mCherry will facilitate research into WNV replication in mouse brains.

• MeSH
• lidé MeSH
• myši MeSH
• rekombinantní proteiny genetika   MeSH
• virus západního Nilu * genetika   MeSH
• západonilská horečka * veterinární   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• myši MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH