Přestože PCR detekce mykotických patogenů v klinických vzorcích se na stránkách odborných časopisů objevuje již více než dvacet let, je použití této metody pro rutinní diagnostiku invazivní aspergilózy stále diskutabilní. A to i přesto, že metody molekulární biologie již našly své stálé místo v mnoha odvětvích moderní mikrobiologie. Genotypizace bakteriálních kmenů rezistentních na antibiotika, molekulární epidemiologie, ale i rutinní detekce, např. virových infekcí z nejrůznějších klinických materiálů je v dnešní době zcela běžnou praxí. Ve všech těchto oblastech znamenalo zavedení metody PCR diagnostiky zrychlení, zfpřesnění a zjednodušení celého procesu. Tento přehledový článek má za cíl ukázat, v čem je detekce původců mykotických infekcí jiná a proč se ji dosud nepodařilo zavést do rutinní praxe.
PCR detection of fungal pathogens in clinical samples has been discussed in journals for more than two decades. However, its use for diagnosing invasive aspergillosis is still controversial, despite the fact that molecular methods are routinely used in various fields of modern microbiology. These are e. g. genotyping of bacterial strains resistant to antibiotics, molecular epidemiology or routine detection of viral infections in clinical material. PCR methods have made the diagnostic apphcations faster, simpler and more accurate. This review deals with issues related to molecular methods for diagnosing invasive fungal infections and the main factors limiting their use in everyday clinical practice.
Cíl práce: Zavedení další bezkultivační metody invazivního meningokokového onemocnění, polymerase chain reaction (PCR), která obohatí současně užívané bezkultivační metody a zvýší procento laboratorně potvrzených onemocnění. Materiál a metody: Metoda PCR byla optimalizována na kmenech Neisseria meningitidis B a C. Senzitivita a specificita PCR detekce Neissera meningitidis B a C z klinického materiálu byla hodnocena na 195 vzorcích likvoru od pacientů s invazivním meningokokovým onemocněním (80 vzorku likvoru), non-meningokokovou bakteriálni meningitidou (49 vzorku likvoru) a virovou meningitidou (66 vzorků likvoru). Výsledky: Pro PCR detekci Neisseria meningitidis B a C z likvoru byly zjištěny následující parametry, senzitivita = 0,85, specificita = 0,95, pozitivní předpovědní hodnota = 0,88 a negativní předpovědní hodnota = 0,93. Metoda PCR posada laboratorní potvrzení etiologie u 47,4 % z 19 vyšetřených likvoru u pravděpodobných invazivních meningokokových onemocnění, jejichž meningokoková etiologie nebyla potvrzena klasickými metodami. V současné době je zaváděna semi-nested PCR strategie k detekci Neisseria meningitidis z likvoru, krve a séra, jakož i rozšířená PCR metoda pro detekci Haemophilus influenzae b a Streptococcus pneumoniae z likvoru, krve a séra. Závěr: V Národní referenční laboratoři pro meningokokové nákazy SZÚ Praha byla zavedena PCR metoda detekce Neisseria meningitidis B a C z likvoru a je nabízena k rutinnímu použití.
Objectives: To introdukce a further non-culture method for diagnosis of invasive meningococcal dinase, polymerase chain reaction (PCR), in addition to those currently used to increase the percentage of laboratory confirmed cases. Materials and methods: The PCR method was optimist on Neisseria meningitidis B and C strains. Sensitivity and specificity of PCR detection of Neisseria meningitidis B and C from clinical material was assessed in 195 samples of the cerebrospinal fluid obtained from patiens with invasive meningococcal dinase (80 CSF samples), non-meningococcal bacterial meningitis (49 CSF samples) and viral meningitis (66 CSF samples). Results: The following parameters of the PCR method for detection of Neisseria meningitidis B and C from the CSF were found: sensitivity = 0.85, specificity = 0.95, positive predictive value = 0.88 and negative predictive value = 0.93. PCR gave laboratory confirmation in 47.4 % of 19 CSF samples from patiens with suspected invasive meningococcal dinase, whose meningococcal infection was not confirmed by classical methods. The semi-nested PCR strategy and an extended PCR method for detection of Haemophilus influenzae h and Streptococcus pneumoniae from CSF, blood and serum has been introduced recently in our laboratory. Conclusions: The PCR method for detection of Neisseria meningitidis B and C from the cerebrospinal fluid was introduced in the National Reference Laboratory for Meningococcal Infections in NIPH, Prague and is propřed for routine use.
- MeSH
- Diagnostic Techniques, Neurological methods MeSH
- Humans MeSH
- Meningitis, Bacterial diagnosis pathology MeSH
- Meningitis, Viral diagnosis pathology MeSH
- Cerebrospinal Fluid MeSH
- Neisseria meningitidis analysis diagnosis pathogenicity MeSH
- Polymerase Chain Reaction microbiology MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
Cíl: Cílem retrospektivní studie bylo sumarizovat a zhodnotit výsledky pacientů s podezřením na infekci rodem Chlamydia vyšetřených pomocí „in house“ metody nested PCR (polymerázová řetězová reakce). Studie pracuje s daty získanými vyšetřením pacientů v letech 2001-2003 z regionu východních Čech na Oddělení molekulární biologie společného pracoviště Ústavu klinické mikrobiologie (ÚKM) a Ústavu klinické biochemie a diagnostiky (ÚKBD). Materiál a metodika: V roce 2001 bylo provedeno 291 vyšetření, v roce 2002 to bylo již 562 a v roce 2003 dokonce 760 vyšetření. Celkem bylo za toto období přijato 1 613 vzorků k vyšetření, z nichž jich bylo 1 587 vyšetřeno (26 nepoužitelných vzorků). Více jak 70 % všech vyšetření se provádělo ze tří druhů materiálu: moči (41,8 % všech vyšetřených vzorků), BALu (bronchoalveolární laváž; 15,3 % všech vyšetřených vzorků) a plné krve (14,9 % všech vyšetřených vzorků). Vyšetření bylo provedeno pomocí „in house“ metody nested PCR využívající primery z oblasti MOMP (ompA) genu Chlamydia spp. Výsledky: Celková pozitivita činila 5,67 %, 1,26 % vzorků bylo vyhodnoceno jako nejasný výsledek a 93,07 % vyšetřovaných vzorků bylo negativních. U mužů byla zachycena PCR pozitivita u 6,11 % a u žen toto číslo činilo 5,35 %. Nejvíce pozitivních vzorků pocházelo z věkových skupin 70-791etých (11,67 %), 10-191etých (6,51 %) a 40-491etých (6,45 %). Celková pozitivita u stěrů z urogenitálního systému byla 6,48 %, z moči 3,92 %, BALu 10,70 % a plné krve 5,51 %.
Purpose of the study. The study was intended to summarize and evaluate the results in patients with a suspected infection by the genus Chiamydia, investigated with an „in-house" method of nested PCR (polymerase chain reaction). The study worked with data from patients living in eastern Bohemia, who were examined in the years 2001-2003 at the Dept. of Molecular Biology a research laboratory shared by the Institute of Clinical Microbiology and the Institute of Clinical Biochemistry and Diagnostics. Material and methods: 291 explorations were done in 2001, in 2002 already 562 and in 2003 their figure reached 760. The total number of samples received for investigation during that period was I 613. 1 587 were actually investigated, 26 were unsuitable and could not be used. More than 70 % of all investigations were done with three types of material: urine (41.8 % of all the investigated samples), BAL (15.3 % of all the investigated samples) and whole blood (14.9 % of all the investigated samples). The investigations were carried out with the „in-house" nested PCR method, which uses primers from the MOMP(ompA) area of the genus Chlamydia spp. Results: Total positivity was 5.67 %, in 1.26 % of the samples the resulted was considered uncertain and 93.07 % of the investigated sampies were negative. In men PCR positivity was 6.11 %, in women 5.35 %. The major proportion of positive samples was from the age groups 70-79 years (11.67 %), 10-19 years (6.51 %) and 40-49 years (6.45 %). Overall positivity in smears from the urogenital system was 6.48 %, from urine 3.92 %, from BAL 10.70 % and from whole blood 5.51 %.
- MeSH
- Molecular Diagnostic Techniques methods MeSH
- Outcome Assessment, Health Care MeSH
- Chlamydiaceae Infections diagnosis pathology MeSH
- Humans MeSH
- Molecular Biology methods MeSH
- Sex Characteristics MeSH
- Polymerase Chain Reaction MeSH
- Population Characteristics MeSH
- Retrospective Studies MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
- Male MeSH
- Female MeSH
- MeSH
- Polymerase Chain Reaction diagnostic use methods MeSH
- DNA, Protozoan genetics MeSH
- Toxoplasma genetics parasitology MeSH
- Toxoplasmosis diagnosis MeSH
- Publication type
- Review MeSH
Cíl práce: Diagnostika virů herpes simplex typu 1 a 2 (HSV-1 a 2) u neuroinfckcí v České republice v období 1997-1998 s použitím průkazu přítomnosti nukleové kyseliny (NK) v mozkomíšním moku (MM) metodou polymerázové řetězové reakce (PCR ). Metodika: Dvoustupňová typově specifická PCR. Výsledky: V období 1997-1998 bylo na třech pracovištích v České republice vyšetřeno celkem 358 MM a v 28 (7,8 %) případech byla prokázána přítomnost HSV-1 nebo 2 NK. Jednalo se o 12 encefalitid, 1 meningoencefalitidu, 5 meningitid a 1 infekci CNS, u kterých byla v MM prokázána přítomnost HSV-l NK. U 6 6 encefalitid a 2 meningitid byla v MM nalezena HSV-2 NK. U jediné neonatální infekce byla HSV-2 NK přítomna ve steru z čípku matky, přítomnost HSV NK v MM dítěte nebyla potvrzena. Závěr: Průkaz přítomnosti NK virů HSV-1 a 2 v MM metodou PCR je v České republice využíván jako rutinní diagnostická metoda při podezření na herpetickou infekci CNS. V období 1997-98 bylo touto metodou zachyceno celkem 28 případů neuroinfěkcí, z toho 19 (68 %) bylo způsobeno HSV typu 1 a 9 (32 %) HSV typu 2.
Objective: The diagnostic of herpes simplex virus types 1 and 2 (HSV-1 and 2) in cases of neuroinfection in the Czech Republic during 1997-1998, using detection of nucleic acid (NA) in cerebrospinal fluid (CSF) by polymerase chain reaction method (PCR). Methods: Two-stage type specific PCR. Results: During 1997-1998, a total of 358 CSF samples were collected at three sites in the Czech Republic; in 28 cases (7.8%) HSV-1 or 2 NA were detected. In 12 cases of encephalitis, 1 case of meningoencephalitis, 5 cases of meningitis and one case of CNS infection the presence ce of HSV-1 NA was detected. HSV-2 NA was detected in 6 cases of meningoencephalitis and 2 cases of meningitis. HSV-2 NA was present in a cervical smear taken from the mother in a single case of neonatal infection. HSV NA was not detected in the CSF of the innfant. Conclusion: Detection of HSV-1 and 2 in CSF by PCR is employed in the Czech Republic as a routine diagnostic method for suspected CNS herpetic infection. During 1997-1998, a total of 28 cases of neuroinfection were diagnosed by this method, of which 19 (68%) were caused by HSV-1 and 9 (32%) by HSV-2.
Cíl práce: Vyvinutí rozšířené polymerázové řetězové reakce (PCR), která umožňuje bezkultivační diagnostiku meningokokové, homofilové a pneumokokové etiologie u závažných onemocnění. Materiál a metody: Metoda PCR byla optimalizována na kmenech Nesseria meningitidis, HaemophiJus influenzae b a Streptococcus pneumoniae. Detekce patogenů z klinického materiálu byla hodnocena na 230 vzorcích od pacientů se závažným onemocněním. Výsledky: Z celkového množství 230 vzorků byly u 103 vzorků (44,7 %) zjištěny pozitivní výsledky PCK. U likvoru bylo procento pozitivity vyšší (57,0 %) než procento pozitivity séra (33,8 %) či krve (33,3 %). Závěr. Metodou PCR lze prokázat bakteriální deoxyribonukleovou kyselinu v klinickém materiálu i po zahájení léčby antibiotiky. Výsledky PCR jsou k dispozici dříve než výsledky kultivace. PCR metoda ve spojení s multilokusovou sekvenční typizací (MLST) umožňuje klonální analýzu etiologických agens i v případě, že nebyla získána kultivací.
Objectives: Development of extended polymerase chain reaction (PCR) for non-culture detection of Nesseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumonie from invasive infections. Materials and methods: A method of PCR was optimalised on strains of Nesseria meningitidis, Haemophilus influenzae b and Streptococcus pneumonic. Detection of pathogens was evaluated on 230 samples from patiens with invasive infection. Results: Positive results of PCR were found in 103 samples of 230 (44.7 %). The percentage of positivity was higher in CSF samples (57.0 %) than in serum (33.8 %) or blood (33.3 %) samples. Conclusion: PCR method enables etiological diagnostics in cases, where antibiotic treatment was started. PCR results are available earlier than the results of cultivation. Multilocus sequence typing (MLST) of PCR products enables clonal analysis of etiological agents even in cases with negative results of cultivation.
- MeSH
- Bacterial Infections diagnosis epidemiology MeSH
- Research Support as Topic MeSH
- Haemophilus influenzae type b pathogenicity MeSH
- Humans MeSH
- Meningitis, Bacterial diagnosis MeSH
- Microbiological Techniques methods MeSH
- Polymerase Chain Reaction MeSH
- Streptococcus pneumoniae pathogenicity MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
- Geographicals
- Czech Republic MeSH
Cíl práce: Ověřit použití komerčně dostupného setu pro rychlou DNA diagnostiku technikou PCR k průkazu komplexu M. tuberculosis v klinickěm materiálu. Metoctika: Bylo vyšetřeno 65 vzorků - 44 (67,7 %) sput a 21 (32,3 %) bronchoalveolárních laváží, resp. bronchiálních aspirátů od nemocných ze spolupracujících pražských plicních a interních klinik. Ze všech vzorků byla vyizolována DNA, amplifikována a amplifikovaný produkt analyzován. Podstatou metody je amplifikace sekvencí DNA specifických pro 65 kDa antigen M. tuberculosis, vymezených 4 primery Mic Tul - Mic Tu4, pomoci tzv. „nested" PCR. Detekce namnoženého úseku DNA byla prováděna v 1,5% agarozovém gelu za přítomnosti ethidiumbromidu. Následovala vizualizace na UV transiluminátoru. Paralelně probíhala přímá mikroskopie a kultivace na pevných a tekutých půdách. Výsledky: Jednotlivé vzorky byly porovnávány s výsledkem pozitivní kontroly, která je součástí setu. Technikou „nested" PCR I bylo M. tuberculosis prokázáno ve 32 (49,2 %) případech, v 8 případech mikroskopicky (12,3 %) a ve 25 případech kultivací (38,5 %). U šesti (9,2 %) vzorků s negativní PCR byly izolovány jiné mykobakteriální druhy - M. gordonae, M. kansasii a M. avium. U sedmi vzorků (10,8 %) bylo M. tuberculosis detekováno pouze pomocí PCR, kultivace i mikroskopie byly negativní. Tento materiál byl opakovaně vyšetřen dalšími amplifikačními technikami (MTD test - Gen - Probe, Inc., San Diego, USA a Amplicor TM - Hoffmann - La Roche, Alameda, USA), u pacientů bylo provedeno i vyšetření sérových protilátek třídy IgG, IgM a IgA a jsou nadále sledováni. U vzorků kultivačně pozitivních nebyl ani v jednom případě zaznamenán negativní výsledek PCR. Senzitivita testu činila 90,3 %, specificita 88,2 %. Závěr: V posledních 10 letech nachází metoda PCR stále častější uplatnění v diagnostice mykobakteriálních infekcí v rutinních laboratořích. Pozornost je soustředěna zvláště na komerčně dostupně, standardizované soupravy umožňující průkaz komplexu M. íufeercu/osis v klinickém materiálu. Vzhledem k výsledkům pilotní studie (vysoká senzitivita a specificita) lze doporučit zkušeným laboratorním pracovníkům (molekulárním biologům) testovanou soupravu k včasné diagnostice tuberkulózy z klinického materiálu.
Objective: Verification of a commercially available kit for rapid DNA diagnostics by the PCR technique in the detection of the M. tuberculosis complex in clinical material. Methods: A total of 65 specimens was examined comprising 44 sputa (67.7 %) and 21 fluids of bronchoalveolar lavages of bronchial aspirates (32.3 %), from patients of cooperating Prague departments of pulmonary diseases and internal medicine. From each specimen DNA was isolated, amplified, and the amplification product was analyzed. The technique is based on amplification of DNA sequences specific for 65 kDa antigen of M. tuberculosis, determined by four primers Mic Tul - Mic Tu4, using the „nested" PCR. The amplified DNA sequence was detected in 1.5% agarose gel in the presence of ethidium bromide and visualized in an UV transilluminator. Specimens were examined in parallel lei by microscopy and cultivation in liquid and solid media. Results: Each specimen was compared with results of a positive control which is in the kit. M. tuberculosis y]2& demonstrated by the „nested" PCR technique in 32 cases (49.2 %), by microscopy in 8 cases (12.3 %), and by cultivation in 25 cases (38.5 %). In 6 PCR-negative specimens (9.2 %) Other species of mycobacteria were isolated, i.e. M. gordonae, M. kansasii, and M. avium. In 7 specimens (10.8 %) M. tuberculosis was detected by PCR only (cultivation and microscopy were negative). These materials were repeatedly examined using other amplification techniques (MTD test - Gen Probe Incs., San Diego and Amplicor™ - Hoffmann - La Roche, Alameda, U.S.A.). The patients were also examined for serum IgC, IgM, and IgA antibodies and are being followed up. All cultivation positive specimens were also PCR-positive. Sensitivity of the test was 90.3 %, and specificity 88.2 %. Conclusions: The PCR technique in the diagnostics of mycobacterial infections in routine laboratories was increasingly implemented during the past ten years. Attention is paticularly focussed on commercially available standartized kits enabling the detection of the M. tuberculosis complex in clinical material. In view of the pilot investigation's results (high sensitivity and specificity) the tested kit can be recommended to experienced laboratory workers (molecular biologists) for early diagnostics of tuberculosis from clinical material.
- MeSH
- Antigens, Bacterial analysis genetics MeSH
- Diagnostic Tests, Routine methods standards MeSH
- DNA, Bacterial analysis MeSH
- Humans MeSH
- Mycobacterium tuberculosis genetics MeSH
- Mycobacterium Infections diagnosis microbiology MeSH
- Polymerase Chain Reaction methods MeSH
- Sensitivity and Specificity MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
Cíl práce: Význam polymerázové řetězové reakce v diagnostice lymeské neuroboreliózy a srovnání s průkazem specifických antiboreliových protilátek. Metodika: Na izolaci DNA z moče a mozkomíšního moku byla použita suspenze pryskyřice Chelex 100. DNA z plazmy byla izolována pomocí komerčního setu QlAamp DNA Mini Kit. PCR probíhala jako dvoustupňová amplifikace („nested“ PCR). Byly použity tři sady primerů: pro plazmidový gen kódující OspC protein a pro chromozomální geny kódující 16S rDNA a flagelin. Výsledky: V prospektivní studii bylo vyšetřeno 25 pacientů s diagnózou lymeské neuroboreliózy. DNA spirochéty byla prokázána V mozkomíšním moku u 12 pacientů (48 %), v moči u 13 (52 %) nemocných a v plazmě u 6 (24 %). Specifické antiboreliové protilátky v séru byly detekovány u 20 (80 %) pacientů a autochtonní produkce antiboreliových IgG protilátek v mozkomíšním moku byla zjištěna u 22 vyšetřovaných. Závěr: Na základě získaných výsledků se domníváme, že PCR na průkaz borelií může vhodně doplňovat diagnostiku lymeské neuroboreliózy, ale nemůže nahradit „klasickou“ sérologii.
Aim: The signifikance of polymerase chain reaction in diagnostics of lyme's neuroborreliosis and comparison with the detection of specific anti-borrelia antibodies. Methods: The suspension of resin Chelex 100 was used for the DNA isolation from urine and cerebrospinal fluid. DNA from plasma was isolated by the QlAamp DNA Mini Kit. The nested PCR was used for DNA amplification. All together free sets of primers were used, one set for plasmid gene coding OspC protein, and two other sets for chromosomal genes coding 16S rDNA and flagelin. Results: Twenty-five patiens with the diagnosis of Lyme neuroborreliosis were evaluated in a prospective study. Spirochetal DNA was found in the CSF of 12 patients (48 %), in the urine of 13 pts. (53 %) and in six pts. In blood plasma (24 %). Specific anti-borrelia antibodies were detected in the serum of 20 pts (80 %) and 22 patients showed autochtonous production of antiborrelia IgG antibodies in thein CSF. Conclusion: Our results have shown that PCR detection of borrelia can serve as a useful addendum to diagnostics of lyme neuroborreliosis but cannot replace the „classic“ serology.
Východiská: Podstatou moderných postupov liečby onkologických pacientov je v dnešnej dobe zacielenie konkrétnych molekúl zapojených do bunkovej signalizácie asociovanej s nádorovou iniciáciou a progresiou. Úspech uvedeného prístupu závisí od správne zvoleného diagnostického testu s vysokou citlivosťou, ktorý identifikuje výskyt a hladinu vybraných biomarkerov u pacientov pre selekciu tých, ktorí budú na liečivo reagovať a budú z neho benefitovať. Vývoj nových technológií a modernizácia tých známych, prispievajú k inováciám molekulárnej charakterizácie karcinómov, ktorá umožňuje detekciu mutačného stavu pacienta s vysokou citlivosťou a špecifickosťou. Cieľ: V práci diskutujeme o využití polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) tretej generácie, tzv. droplet digitálnej PCR (ddPCR), v molekulárnej diagnostike karcinómov. Podľa štúdií uvedených v našom prehľade predstavuje ddPCR sľubný nástroj pri vytváraní genetického profilu pacientov s onkologickým ochorením. Optimalizácia a presná validácia môžu preto umožniť postupnú implementáciu ddPCR do klinickej praxe v oblasti onkológie.
Background: Nowadays, modern treatment methods for cancer patients are based on targeting specific molecules involved in cellular signaling system associated with tumor initiation and progression. The success of such approach depends on a correctly chosen diagnostic test with high sensitivity that identifies the occurrence and level of biomarkers in patients to select those who will respond and benefit from the treatment. The development of new technologies and the upgrades of the known ones contribute to the innovations in molecular characterization of cancer, which allows the detection of patient’s mutational status with high sensitivity and specificity. Purpose: Here, we discuss the utilization of the third-generation type of polymerase chain reaction (PCR), droplet digital PCR (ddPCR), in the molecular diagnostics of oncology diseases. According to the studies reported in our review, ddPCR represents a promising tool in genetic profiling of cancer patients. Therefore, the optimization and precise validation may enable gradual implementation of ddPCR into clinical practice in the field of oncology.
- Keywords
- ddPCR,
- MeSH
- Molecular Diagnostic Techniques methods MeSH
- Humans MeSH
- Biomarkers, Tumor MeSH
- Neoplasms * diagnosis MeSH
- Check Tag
- Humans MeSH
- Publication type
- Review MeSH
