V této prospektivní studii shrnujeme naše zkušenosti se zavedením nové neinvazivní metody prenatálnídiagnostiky RHD genotypizace plodu z periferní krve těhotných žen s využitím PCR v reálném časea specifických primerů a TaqMan sond pro exon 7 a exon 10 RHD genu. Celkem jsme analyzovali 46vzorků od 39 RhD negativních těhotných žen (z toho 5 aloimunizovaných: 1x anti-D, 2x anti-D a anti-Ca 2x přítomnost nespecifických protilátek v enzymatickém testu). Výsledky neinvazivní prenatálníRHD genotypizace plodu provedené na DNA extrahované z periferní krve matek jsme korelovalis výsledky imunohematologické analýzy pupečníkové krve po porodu dítěte. Výsledky genotypizaceplodu v oblasti exonu 7 RHD genu byly ve shodě s vyšetřením pupečníku u všech těhotných žen, kterédoposud porodily (n = 20, z toho 12 RhD pozitivních a 8 RhD negativních dětí). V případě genotypizaceplodu v oblasti exonu 10 RHD genu jsme nedetekovali RhD pozitivitu plodu u 10 z 12 těhotenství.Předpokládáme, že tyto dva falešně negativní výsledky mohly být způsobeny částečnou delecí neboaberacemi RHD genu v 3´ netranslatované oblasti exonu 10, kde se specifické primery a TaqMan sondaváží k cílové DNA. Specificita metody pro oba RHD (exon 7 a exon 10) RQ-PCR systémy dosáhla 100 %,jelikož jsme v periferní krvi těhotných žen, které porodilyRhDnegativní děti (n = 8),nedetekovali žádnéRHD pozitivní amplifikační signály. Neinvazivní predikce RhD statutu plodu je rychlá a spolehliváa může být zahrnuta do rutinních vyšetření prenatální diagnostiky. Pro spolehlivou diagnostiku všakdoporučujeme, aby byla vždy prováděna amplifikace alespoň dvou různých oblastí RHD genu. NeinvazivníprenatálníRHD genotypizace plodu umožňuje identifikaci plodů v riziku hemolytického onemocnění.Doporučujeme, aby byl v průběhu těhotenství u každé RhD negativní ženy vyšetřen neinvazivněRHD genotyp plodu, nejlépe v I. nebo II. trimestru, a to i u nesenzibilizovaných těhotenství, kterých jevětšina.

In this prospective study, we assessed the feasibility of fetal RHD genotyping by analysis of DNAextracted from maternal plasma samples collected from RhD negative pregnant women using RQ-PCRand primers and probes targeted toward exon 7 and exon 10 of RHD gene.We analysed 46 samples from39 RhD negative pregnant women including 5 sensitised (1x anti-D, 2x anti-D and anti-C, 2x non-specificantibodies in enzymatic assay) and correlated the results with serological analysis of cord blood afterthe delivery. Non-invasive prenatal fetal RHD exon 7 genotyping analysis of maternal plasma sampleswas in complete concordance with the analysis of cord blood in all 20 RhD negative pregnant womendelivering 12RhDpositive and8RhDnegativenewbornsuntilnow.RHDexon 10 specificPCRampliconswere not detected in 2 out of 12 studied plasma samples from women bearing RhDpositive fetus, despitethe positive amplification in RHD exon 7 region observed in all cases. We supposed that false negativeresults might be caused by a partly deletion or aberrant structure of the 3´ untranslated exon 10 regionof RHD gene where specific primers and probe should anneal. The specificity of both RHD exon 7 andexon 10 systems approached 100% since no RHD positive signals were detected in women currentlypregnant with RhD negative fetus (n = 8). Prediction of fetal Rhesus D status from maternal plasma ishighly accurate and enables implementation into clinical routine. We suggest that safe non-invasiveprenatal fetal RHD genotyping using maternal plasma should involve the amplification of at least twoRHD specific products. Fetal RHD genotyping may allow the identification of fetuses at risk ofhaemolytic disease of newborn. However,we suggest to apply a non-invasive prenatal RHD genotyping assay in the routine testing of allRhDnegativewomen involving both sensitised as well as nonsensitizedpregnancies, which is the majority.

• MeSH
• DNA krev   MeSH
• dospělí MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• genotyp metody   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci plodu diagnóza   genetika   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• prospektivní studie MeSH
• Rho(D) imunoglobulin genetika   krev   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

Vtéto prospektivní studii shrnujeme naše zkušenosti se zavedenímnové neinvazivnímetody prenatálníRHD, RHC a RHE genotypizace plodu z periferní krve RhD negativních těhotných žen s využitím PCRv reálném čase a specifických primerů a TaqMan sond navržených pro RHD a RHCE geny. Celkem bylotestováno 29 RhD negativních těhotných žen v rozmezí 14. a 40. týdne gravidity.Výsledky neinvazivníprenatální RHD, RHC a RHE genotypizace plodu provedené na DNA extrahované z periferní krvematek jsme korelovali s výsledky imunohematologické analýzy pupečníkové krve po porodu dítěte.Výsledky genotypizace plodu v oblasti exonu 7 a exonu 10 RHD genu byly ve shodě s vyšetřenímpupečníku u 29 z 29 RhD negativních těhotných žen, které porodily 13 RhD pozitivních a 16 RhDnegativních dětí. RHC genotypizace plodu v oblasti exonu 2 byla správně provedena u 25 z 25 Rhchomozygotních těhotných žen, z toho 8 žen porodilo RhC pozitivní a 17 RhC negativní děti. RHEgenotypizace plodu byla rovněž správně provedena u 29 z 29 Rhe homozygotních těhotných žen, z toho5 žen porodilo RhE pozitivní a 24 RhE negativní děti. RHC a RHE genotypizace plodu je velmi cennázejména v případě identifikace RhD negativního plodu vzhledem k amplifikaci další paternálně zděděnéalely, jež je průkazem přítomnosti fetálníDNAvmateřské cirkulaci.Doporučujeme proto provádětsimultánní RHD, RHC a RHE genotypizaci plodu u RhD negativních aloimunizovaných těhotenství veII. nebo III. trimestru gravidity za předpokladu, že matka nese příslušný Rh fenotyp (ccee, ccEe, Ccee).

In this prospective study,we assessed the feasibility of foetalRHD,RHCandRHEgenotyping by analysisof DNA extracted from maternal plasma samples collected from RhD negative pregnant women usingRQ-PCR and primers and probes targeted toward RHD and RHCE genes.We analysed 29 RhD negativepregnant women within 14th and 40th week of pregnancy and correlated the results with serologicalanalysis of cord blood after the delivery. Non-invasive prenatal foetal RHD exon 7 and exon 10genotyping analysis of maternal plasma samples was in complete concordance with the analysis of cordblood in 29 out of 29 RhD negative pregnant women delivering 13 RhD positive and 16 RhD negativenewborns. Non-invasive prenatal foetal RHC exon 2 genotyping was well performed in 25 out of 25 Rhchomozygote pregnant women delivering 8 RhC positive and 17 RhC negative newborns. Similarlynon-invasive prenatal foetal RHE genotyping was well done in 29 out of 29 Rhe homozygote pregnantwomen delivering 5 RhE positive and 24 RhE negative newborns. Foetal RHC and RHE genotyping inRhD negative pregnancies is very valuable, since in case of identification of RhD negative fetussimultaneous amplification of another paternally inherited allele (RhC or RhE positivity) proves thepresence of foetal DNA in maternal circulation. We recommend to perform simultaneous foetal RHD,RHC and RHE genotyping in alloimunised RhD negative pregnancies with certain phenotypes (ccee,ccEe, Ccee).

• MeSH
• dospělí MeSH
• fenotyp MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• genotyp MeSH
• hematologické komplikace těhotenství diagnóza   terapie   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci plodu diagnóza   genetika   MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• prenatální diagnóza metody   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin genetika   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

Úvod: V České republice se stanovuje na začátku těhotenství RhD krevní skupina, cílem screeningu je diagnostikovat RhD negativní těhotné ženy, které mohou být ohroženy rozvojem RhD aloimunizace, to nastává pouze v případě, že plod je RhD pozitivní. V současné době se prevence RhD aloimunizace provádí bez ohledu na znalost RHD statutu plodu. Již na začátku těhotenství je možné stanovit RHD genotyp plodu neinvazivně z volné fetální DNA cirkulující v mateřské periferní krvi. Problematika screeningového vyšetření RHD genotypu plodu je celosvětově řešena. V některých evropských zemích je vyšetření již rutinně zavedeno, a přispívá tak k optimalizaci prenatální péče o RhD negativní těhotné, aplikace imunoglobulinu je cílená pouze u těhotenství s RhD pozitivním plodem. Cílem naší práce je zhodnotit klinickou a laboratorní efektivitu screeningu RHD genotypu plodu u RhD negativních žen metodou TaqMan Real-time PCR. Typ studie: Prospektivní kohortová studie. Název a sídlo pracoviště: Porodnicko-gynekologická klinika LF UP a FN Olomouc; Ústav lékařské genetiky LF UP a FN Olomouc; Transfuzní oddělení FN Olomouc; Ústav lékařské biofyziky LF UP Olomouc. Materiál a metodika: V letech 2011–2015 ve Fakultní nemocnici Olomouc bylo provedeno 337 vyšetření RHD genotypu plodu u těhotných žen v I. a II. trimestru a hodnoceno pomocí TaqMan Real-time PCR. Výsledek byl poté ověřen na RHD genotypu novorozence. Výsledky: Metodika vyšetření RHD genotypu plodu je přesná, spolehlivá a využitelná v klinické praxi. Senzitivita byla 97,8 %, specificita byla 98,7 %. Při hodnocení efektivity zavedení neinvazivního screeningu RHD genotypu plodu u RhD negativních žen je nutné současně hodnotit hledisko medicínské, organizační i ekonomické. Důslednější provádění prevence RhD aloimunizace ve skutečně indikovaných případech může vést ke snížení incidence RhD aloimunizace. Závěr: Z medicínského hlediska je stanovení RHD genotypu plodu u všech RhD negativních žen na začátku těhotenství jednoznačně efektivní. Umožní diagnostikovat přibližně 40 % RhD negativních plodů, kdy ženě není třeba podat IgG anti-D. Stanovení RHD genotypu plodu pomocí metodiky TaqMan Real-time PCR genotypu plodu je využitelné v klinické praxi.

Objective: In the Czech Republic in all women within a first trimester screening a laboratory testing for RhD blood group from the peripheral blood should be performed. The aim of the screening is to diagnose RhD negative pregnant women, who may be at risk of developing RhD alloimmunization if the fetus is RhD positive. Currently, the prevention of RhD alloimmunization is carried out regardless of the knowledge of RHD fetal status. Already at the beginning of pregnancy it is possible to determine the RHD genotype of the fetus non-invasively due to cell free fetal DNA circulating in maternal peripheral blood detection. The issue of screening examination of fetal RHD genotype is solved worldwide. In some European countries, the examination is routinely established and thus contributes to the optimization of prenatal care for RhD negative pregnant women, immunoglobulin administration is targeted only in pregnancies with RhD positive fetus. The aim of our study is to evaluate clinical and laboratory effectiveness of fetal RHD genotype screening in RhD negative women by TaqMan Real-time PCR method. Designe: Prospective cohort study. Setting: Obstetrics and Gynecology Clinic of the Faculty of Medicine University Palacky and the University Hospital Olomouc; Institute of Medical Genetics of the Faculty of Medicine UP and the University Hospital Olomouc; Transfusion Department of the University Hospital Olomouc; Institute of Biophysics of the Faculty of Medicine UP Olomouc. Material and methods: In 2011-2015 at the University Hospital Olomouc 337 examinations of RHD fetal genotype were performed in pregnant women in first and second trimester and evaluated by TaqMan Real-time PCR, followed by verification of the newborn RHD genotype. Results: Methodology of fetal RHD genotype examination is accurate, reliable and useful in clinical practice. The sensitivity was 97.8%. The specificity was 98.7%. When assessing the effectiveness of the introduction of non- -invasive fetal RHD genotype screening in RhD negative women, it is necessary to assess the medical, organizational and economic aspects. More consistent prevention of RhD alloimmunization in the cases actually indicated may reduce the incidence of RhD alloimmunization. Conclusion: From the medical point of view the RHD genotype determination in all RhD negative women at the beginning of pregnancy seems effective. It allows to diagnose about 40% of pregnancies with RhD negative fetuses that do not require administration of IgG anti-D. IgG anti-D should be administered only in indicated cases. Determination of fetal RHD genotype by using TaqMan Real-time PCR is useful in clinical practice.

• Klíčová slova
• RhD negativní žena, volná fetální DNA, prevence RhD aloimunizace, RHD genotyp plodu,
• MeSH
• genotyp MeSH
• hematologické komplikace těhotenství * diagnóza   MeSH
• lidé MeSH
• neinvazivní prenatální testování MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• prenatální diagnóza * metody   MeSH
• prospektivní studie MeSH
• Rho(D) imunoglobulin analýza   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Events following which immunoglobulin (Ig) G anti-D should be given to all RhD negative women with no anti-D alloantibodies: First trimester indications (IgG anti-D sufficient dose of 50 μg*) - termination of pregnancy, spontaneous abortion followed by instrumentation, ectopic pregnancy, chorionic villus sampling, partial molar pregnancy; Second and third trimester indications (IgG anti-D sufficient dose of 100 μg*) - amniocentesis, cordocentesis, other invasive prenatal diagnostic or therapeutic procedures, spontaneous or induced abortion, intrauterine fetal death, attempt at external cephalic version of a breech presentation, abdominal trauma, obstetric hemorrhage; Antenatal prophylaxis at 28th weeks of gestation (IgG anti-D sufficient dose of 250 μg*); Delivery of an RhD positive infant** (IgG anti-D sufficient dose of 100 μg*); Minimal dose*: before 20 weeks gestation – 50 μg (250 IU), after 20 weeks gestation*** – 100 μg (500 IU); Timing: as soon as possible, but no later than 72 hours after the event. In cases where prevention of RhD alloimmunization is not performed within 72 hours of a potentially sensitising event, it is still reasonable to administer IgG anti-D within 13 days, and in special cases, administration is still recommended up to a maximum interval of 28 days postpartum; Legend: *administration of a higher dose of IgG anti-D is not a mistake, ** also if the D type is not known, *** simultaneous assessment of the volume of fetomaternal hemorrhage (FMH) to specify the dose is suitable; The FMH volume assessment - If the volume of fetal erythrocytes (red bood cells, RBCs) which entered maternal circulation is assessed, intramuscular administration of IgG anti-D in a dose of 10 μg per 0.5 mL of fetal RBCs or 1 mL of whole fetal blood is indicated. IgG anti-D in a dose of 10 μg administered intramuscularly should cover 0.5 mL of fetal RhD positive RBCs or 1mL of whole fetal blood. FMH is the fetal RBC volume; fetal blood volume is double (expected fetal hematocrit is 50%).

• Klíčová slova
• RhD negative women, RhD alloimmunization, immunoglobulin G anti-D, doporučený postup ČGPS ČLS JEP,
• MeSH
• hematologické komplikace těhotenství MeSH
• lidé MeSH
• Rh izoimunizace * imunologie   prevence a kontrola   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin aplikace a dávkování   terapeutické užití   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• směrnice pro lékařskou praxi MeSH

Cíl studie: Zjistit incidenci spontánní antepartální RhD aloimunizace u RhD negativních těhotných žen s RhD pozitivním plodem. Typ studie: Původní práce. Název a sídlo pracoviště: Porodnicko-gynekologická klinika FN Olomouc. Metodika: Celkem bylo vyšetřeno 906 RhD negativních žen s RhD pozitivním plodem a bez přítomnosti aloprotilátek anti-D na začátku těhotenství. Vždy se jednalo o jednočetné těhotenství, RhD krevní skupina ženy byla stanovena v I. trimestru těhotenství, RhD skupina plodu byla určena po porodu. Screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek byl všem ženám proveden v I. trimestru těhotenství, ve 28.–32. týdnu těhotenství a bezprostředně před porodem ve 38.–42. týdnu. Pokud byly u těhotné ženy před porodem diagnostikovány aloprotilátky anti-D, byl vždy proveden screening protilátek i následně za šest měsíců po porodu. Screening protilátek byl proveden v nepřímém antiglobulinovém (LISS/NAT) a enzymovém (papain) testu s jejich následnou identifikací pomocí panelu typových erytrocytů metodou sloupcové aglutinace Dia-Med. Po porodu byl u všech RhD negativních žen stanoven objem fetomaternální hemoragie a byla provedena prevence RhD aloimunizace podáním potřebné dávky IgG anti-D, antepartálně nebyl IgG anti-D žádné ženě podán. Výsledky: Při kontrolním screeningu nepravidelných antierytrocytárních protilátek ve 28.–32. týdnu těhotenství byly aloprotilátky anti-D diagnostikovány u 0,2 % žen (2/906), bezprostředně před porodem ve 38.–42. týdnu těhotenství byly diagnostikovány aloprotilátky anti-D u 2,3 % žen (21/906) a opakovaně i za šest měsíců po porodu (21/157). U 82,7 % žen (749/906) však nebylo vyšetření za šest měsíců po porodu provedeno, a nelze u nich tudíž spolehlivě vyloučit spontánní antepartální RhD aloimunizaci, která nemusela být v termínu porodu ještě diagnostikovatelná. Při nepřítomnosti aloprotilátek anti-D před porodem byl všem ženám po porodu podán IgG anti-D v dávce minimálně 125 μg intramuskulárně. Závěr: U RhD negativních žen s RhD pozitivním plodem byla incidence spontánní antepartální RhD aloimunizace minimálně 2,3 %. Většině případů lze teoreticky zabránit preventivním podáním IgG anti-D v dávce 250 μg intramuskulárně všem RhD negativním ženám ve 28. týdnu těhotenství.

Aim of the study: Assess the incidence of spontaneous antepartal RhD alloimmunization in RhD negative pregnant women with an RhD positive fetus. Design: Clinical study. Setting: Department of Obstetrics and Gynecology, Medical School and University Hospital Olomouc. Methods: A total of 906 RhD negative women with an RhD positive fetus and without the presence of anti-Dalloantibodies at the beginning of pregnancy were examined. Always it was a singleton pregnancy, RhD blood group of the pregnant women was assessed in the 1st trimester of pregnancy, RhD status of the fetus was determined after delivery. Screening for irregular antierythrocyte antibodies was performed in all women in the 1st trimester of pregnancy, at 28–32 weeks gestation and immediately prior to delivery at 38–42 weeks gestation. Screening for irregular antierythrocyte antibodies was performed also at 6 months following delivery in all cases of positive antibodies before delivery. Antibody screening was performed using the indirect antiglobulin (LISS/NAT) and enzyme (papain) test with their subsequent identification using a panel of reference erythrocytes by column agglutination method Dia-Med. After delivery, the volume of fetomaternal hemorrhage was assesed in all RhD negative women and RhD alloimmunization prophylaxis was performed by administering the necessary IgG anti-D dose; none of the women were administered IgG anti-D antepartally. Results: During screening for irregular antierythrocyte antibodies at 28–32 weeks gestation, anti-D alloantibodies were diagnosed in 0.2% of the women (2/906); immediately prior to the delivery at 38-42 weeks gestation, anti-D alloantibodies were diagnosed in 2.3% of the women (21/906) and repeatedly even at 6 months following delivery (21/157). In 82.7% of the women (749/906), examination at 6 months following delivery was not performed, therefore in these women spontaneous antepartal RhD alloimmunization cannot reliably be ruled out. Alloimmunization may not be diagnosed yet at term of delivery. If anti-D alloantibodies were not present prior to the delivery, these women were all administered IgG anti-D in a dose of at least 125 μg after delivery. Conclusion: In RhD negative women with an RhD positive fetus, the incidence of spontaneous antepartal RhD alloimmunization was at least 2.3%. Most cases may theoretically be prevented by prophylactic administration of 250 μg of IgG anti-D to all RhD negative women at 28 weeks gestation.

• MeSH
• aglutinační testy MeSH
• fetomaternální transfuze MeSH
• hematologické komplikace těhotenství prevence a kontrola   MeSH
• incidence MeSH
• komplikace těhotenství MeSH
• lidé MeSH
• plod imunologie   MeSH
• plošný screening MeSH
• první trimestr těhotenství MeSH
• reakce antigenu s protilátkou MeSH
• Rh izoimunizace * diagnóza   prevence a kontrola   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin terapeutické užití   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Events following which anti-D immunoglobulin should be given to all RhD negative women with no anti-D antibodies: First trimester indications (50 µg) - termination of pregnancy, spontaneous abortion followed by instrumentation, ectopic pregnancy, chorionic villus sampling, partial molar pregnancy; Second and third trimester indications (100 µg) – amniocentesis, cordocentesis, other invasive prenatal diagnostic or therapeutic procedures, spontaneous or induced abortion, intrauterine fetal death, attempt at external cephalic version of a breech presentation, abdominal trauma, obstetric haemorrhage; Antenatal prophylaxis at 28th weeks of gestation (250 µg); Delivery of an RhD positive infant * (100 µg); Minimal dose: before 20 weeks gestation - 50 µg (250 IU), after 20 weeks gestation ** - 100 µg (500 IU); Timing: as soon as possible, but no later than 72 hours after the event. In cases where prevention of RhD alloimmunization is not performed within 72 hours of a potentially sensitising event, it is still reasonable to administer anti-D immunoglobulin (IgG anti-D) within 13 days, and in special cases, administration is still recommended up to a maximum interval of 28 days postpartum.; FMH (fetomaternal haemorrhage) - If the amount of fetal erythrocytes which entered the maternal circulation is quantitatively determined, administration of 10 µg IgG anti-D per 0.5 ml of fetal erythrocytes or 1 ml of whole blood is indicated. *also if the RhD type of the infant has not been determined or is in doubt, **in conjunction with a test to assess the volume of any fetomaternal hemorrhage.

• MeSH
• lidé MeSH
• Rh izoimunizace prevence a kontrola   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin terapeutické užití   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Erytrocytární aloimunizace (izoimunizace, hemolytické onemocnění plodu a novorozence – HON) se v současnosti díky rutinní imunoprofylaxi anti-D imunoglobulinem vyskytuje sporadicky. Výskyt atypických aloimunizací non-RhD-antigeny zůstává neměnný, poněvadž není známa profylaxe a ani prevence nezajišťuje stoprocentní účinnost. Pokud se imunoprofylaxe anti-D imunoglobulinem neprovede nebo selže, hrozí vznik hemolytického onemocnění plodu a novorozence. Každý případ je potom unikátní (specifita a typ protilátky, blokující protilátky v séru matky, antigenní výbava erytrocytů plodu, gestační stáří při začátku onemocnění atd). Pokroky v genové diagnostice, imunohematologii a dopplerovské ultrasonografii významně snižují frekvenci nutných invazivních zákroků v diagnostice a léčbě senzibilizovaného těhotenství. Intraumbilikální přísně intravenózní transfuze pod ultrasonografickou kontrolou je první metodou volby léčby případů s těžkou anémií plodu i při rozvinutém hydropsu. Konzultace a léčba se soustřeďují do center s perfektní porodnickou a neonatologickou péčí a nepřetržitou operační pohotovostí. Klíčová slova: anti-D-imunoglobulin – erytrocytární aloimunizace – hemolytické onemocnění plodu a novorozence – imunoprofylaxe anti-D-imunoglobulinem – intraumbilikální intravenózní transfuze

The erythrocyte alloimmunization (isoimmunization, hemolytic disease of the fetus and newborn – HON) occurs sporadically at present, thanks to routine immunoprophylaxis with anti-D immunoglobulin. The occurrence of atypical alloimmunizations related to non-RhD-antigens remains unchanged, as there is no prophylaxis known and even the prevention does not provide one hundred percent efficiency. When anti-D immunoglobulin immunoprophylaxis is not undertaken or fails, the threat of hemolytic disease of the fetus and newborn arises. Every case is then unique (specificity and type of antibody, blocking antibodies in maternal serum, antigenic make-up of fetal erythrocytes, gestational age at the disease onset etc). The advancements in genetic diagnostics, immunohematology and Doppler ultrasonography significantly reduce the frequency of necessary invasive interventions in the diagnostics and treatment of sensibilized pregnancy. Intraumbilical strictly intravenous transfusion under ultrasound guidance is the first-line method of therapy for cases of severe fetal anemia as well as advanced hydrops. Consultations and treatment are provided in the centres for comprehensive obstetrical and neonatal care with continuous intervention preparedness. Key words: anti-D immunoglobulin – erythrocyte alloimmunization – hemolytic disease of the fetus and newborn – anti-D immunoglobulin immunoprophylaxis – intraumbilical intravenous transfusion

• Klíčová slova
• intraumbilikální intravenózní transfuze,
• MeSH
• anemie diagnóza   MeSH
• arteria cerebri media MeSH
• Coombsův test MeSH
• fetální krev imunologie   MeSH
• hematologické komplikace těhotenství * MeSH
• hemolytická nemoc plodu a novorozence * diagnóza   prevence a kontrola   terapie   MeSH
• imunizace metody   MeSH
• imunologické faktory aplikace a dávkování   škodlivé účinky   terapeutické užití   MeSH
• intrauterinní krevní transfuze * kontraindikace   metody   škodlivé účinky   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci plodu diagnóza   MeSH
• novorozenec MeSH
• plod krevní zásobení   MeSH
• postnatální péče MeSH
• předčasný porod MeSH
• pupečník imunologie   krevní zásobení   MeSH
• Rh izoimunizace * diagnóza   prevence a kontrola   terapie   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin * aplikace a dávkování   škodlivé účinky   terapeutické užití   MeSH
• rychlost toku krve MeSH
• těhotenství MeSH
• transfuze erytrocytů MeSH
• ultrasonografie dopplerovská MeSH
• ultrasonografie prenatální MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• novorozenec MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

Rh systém je řazen mezi klinicky nejvýznamnější systémy antigenů lidských krevních skupin. Jehomolekulárním podkladem jsou dva vysoce homologní geny (RHD a RHCE), lokalizované v těsné blízkostia v opačné orientaci na prvním chromozomu (1p34-36). Produkty genů jsou dva proteiny, RhDa RhCcEe, které nesou Rh antigeny. RhD protein je nejimunogennějším antigenním komplexem membrányerytrocytu – stav RhD negativity je totiž charakterizován jeho úplnýmchyběním, proto imunitnísystém osob s tímto fenotypem velice silně reaguje na kontakt s RhD pozitivními erytrocyty (častátvorba protilátek při těhotenství nebo po transfuzi). Ostatní antigenní rozdíly (C+/-, c+/-, E+/-, e+/- aj.)představují na rozdíl od D+/- pouze rozdíl v jedné či několika málo aminokyselinách téhož proteinu,tudíž nemají tak velký imunogenní potenciál (1, 11). Detekce RhD antigenu je komplikována tím, že asi1–2 % RhD pozitivních osob má RhD protein s atypickou expresí. Mezi těmito rozeznáváme prosté,kvantitativní zeslabení exprese (menší počet kopií proteinu) a variantní, kvalitativně odlišné proteiny.Podkladem prvního typu jsou mutace RHD genu s následnými aminokyselinovými substitucemi, kteréneovlivňují extramembranózní část proteinu (1, 11). Mutace a přestavby RHD genu u druhého typu,RhD variant, mění v různém rozsahu extramembranózní tvar proteinu, který představuje (z „pohledumonoklonálních protilátek“) soubor několika desítek D epitopů. Chybění jednoho nebo více těchtoepitopů je jednak diagnostickým příznakem RhD variant a jednak má za následek, že osoby s RhDvariantním fenotypem se mohou imunizovat při kontaktu s „normálním“ RhD proteinem – vytvářejíprotilátky právě proti jim chybějícím epitopům. Podkladem RhD variant je tedy abnormální RHD gen,který se může sérologicky (= chyběním D epitopů) projevit jen pokud je na druhém z páru chromozomůalela pro RhD negativitu (1, 11).

Rh system belongs to the most important blood group systems. Its molecular basis are two highlyhomologous genes (RHD a RHCE) localized in closed proximity and in opposite orientation on the firstchromozome (1p34-36). Products of these genes are two proteins, RhD and RhCcEe, carrying the Rhantigens. RhD protein is the most immunogenic antigen complex of the red cell membrane – RhDnegative phenotype is characterized by its total absence – that iswhy the immune system of RhD- peopleis very sensitive to contact with RhDpositive erythrocytes (frequent antibody production in pregnancyor after transfusion of RhD+ red cells). Other antigenic differences (C+/-, c+/-, E+/-, e+/- aj.) on the otherhand are represented by only one or few aminoacid substitutions in one protein and therefore are muchless immunogenic. The detection of RhD in cca 1–2% RhD positive samples is complicated by theabnormal expression of the protein, which can be divided into quantitative weakening (less proteincopies on the membrane) and into qualitative variants. First type (weak D) is based on RHD(weak) genemutations which do not affect the extramembranousportion of the protein.The second type (D variants)is based on RHD(variant) gene with alteration(s) resulting in the loss of one or more D epitopes – thisfeature is used the serologic characterisation of variants and is the cause of their clinical importance(carriers of D-epitope deficient phenotype are able to form antibodies against „missing“ part of theprotein when contacted with „normal“ RhD positive red cells). This article is describing one uniqueRhD variant – RoHar, which dramatically differs from other types due to its molecular background(presence of only one hybrid RHCE-RHD(5)-RHCE gene) as well as serologic characteristics (unusualnegative reactions with most IgG anti-D in the antiglobulin test), causing frequent discrepancies anddiagnostic complications.

• MeSH
• antigeny MeSH
• epitopy MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• geny MeSH
• krevní skupiny - systém Rh-Hr fyziologie   genetika   MeSH
• lidé MeSH
• proteiny MeSH
• Rho(D) imunoglobulin MeSH
• sérologické testy metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

RhDantigen je hlavním antigenem Rh systému a jednímz klinicky nejvýznamnějších antigenů lidskýchčervených krvinek vůbec. Jeho správné určení má velký význam při prevenci hemolytických potransfuzníchreakcí a při prevenci a léčbě hemolytického onemocnění novorozence. Stanovení RhD jekomplikováno existencí řady kvalitativně (= variantní D antigeny) a kvantitativně (= slabé D antigeny)odlišných forem RhD proteinu. Znalost zastoupení jednotlivých variantních a slabých D antigenů jedůležitá pro správnou volbu anti-D diagnostik a pro doporučení transfuzní substituce a imunoprofylaxev těhotenství. Autoři přinášejí první rozsáhlejší studii atypických D antigenů v naší populaci.Nejčastějšími zjištěnými variantami u nás jsou D VI (10krát),DFR (7krát) aD VII (6krát), poměrně často(3krát) byla zjištěna též varianta DCS (dosud nedetekovaná v jiné populaci). Zachycena byla téžvarianta D IVb a raritní varianty DOL a DYO. Aloimunizace byla zjištěna u variant D IIIc, D VII a DNB.U osob s fenotypem R1r bylo mezi atypickými antigeny nalezeno asi 7 % variantních D, ale u osobs fenotypemR2r bylo variantníchD5krát více –Rh fenotyp tedy může být vodítkem pro volbu substitucea profylaxe v období před upřesněním typu variantního či slabého D antigenu. Ve studii byly zjištěnymožnosti a limity použití komerčních kitů pro feno- a genotypovou detekci atypických D monoklonálnímiprotilátkami a PCR-SSP v naší populaci.

RhD antigen is the main antigen of the Rh system and belongs to the clinically most relevant antigensof the human red cell. Correct determination of the RhD status is important for the prevention ofhaemolytic transfusion reactions and for prevention and treatment of the haemolytic disease of thenewborn. Numerous atypical forms of RhD protein (D variants = qualitative changes; weak D =quantitative changes) complicate RhD assessment. Knowledge of the frequency of variant and weak Dtypes in the population is helpful for the choice of optimal anti-D reagents and for transfusion andimmunoprophylactic recommendations. The authors present the first extensive study of atypical Dantigens in the Czech population.Most frequent variants detected were D VI (10x), DFR (7x) and D VII(6x), relatively frequent (3x) was DCS variant, which was so far detected only in the local population.In our study we detected also DIVb and rare variants DOL and DYO. Alloimmunization was detectedin patients with variants D IIIc, D VII and DNB. In carriers atypical D antigen in Rh phenotype R1r thefrequency of D variants was cca 7% while in Rh phenotype R2r was five times more frequent – Rhphenotype could serve as a guide for safer substitution and prophylaxis before definitive assessmentof the D weak or variant type. Possibilities and limits of use of commercial kits for D pheno- andgenotyping in the Czech population are discussed.

• MeSH
• antigenní variace MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• HLA-D antigeny MeSH
• krevní skupiny - systém Rh-Hr MeSH
• lidé MeSH
• mapování epitopu metody   MeSH
• monoklonální protilátky diagnostické užití   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• Rho(D) imunoglobulin MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

Cíl studie: Doposud používaný ABI PRISM 7700 sekvenční detekční systém se již přestal vyrábět, řada laboratoří je proto nucena převést dosavadní neinvazivní prenatální diagnostiku na nové přístrojové vybavení. V této studii se zaměřujeme na testování použití 7300 real-time PCR systému pro účely rutinního neinvazivního určení pohlaví, RHD a RHCE genotypu plodu. Název a sídlo pracoviště: Laboratoř buněčné biologie, Pediatrická klinika, 2. LF UK a FN Motol Praha. Materiál a metody: Hodnotíme amplifikaci paternálních alel na extracelulární DNA izolované z mateřské periferní krve pomocí QIAamp DSP Virus kitu (c a E alely RHCE genu) a QIAamp DNA Blood Mini kitu (SRY, RHD a C alela RHCE genů) u 22 těhotných žen v rozmezí 10.–38. týdne gravidity. Výsledky: SRY (n = 6), RHD (exon 7 a exon 10, n = 7) a RHCE (C alela, n = 3; c alela, n = 3; E alela, n = 3) genotypizace plodu provedené na 7300 real-time PCR systému byly ve shodě s pohlavím a Rh fenotypem plodu či narozeného dítěte u všech vyšetřených těhotných žen. Závěr: Prokázali jsme, že 7300 real-time PCR systém je dostatečně citlivý pro detekci paternálních alel na fetální DNA přítomné v extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy. Tímto způsobem můžeme nadále i po vyřazení ABI PRISM 7700 sekvenčního detekčního systému z provozu zajišťovat spolehlivé neinvazivní určení pohlaví plodu u těhotenství s rizikem X-vázaných onemocnění u plodu a neinvazivní RHD a RHCE genotypizaci plodu u aloimunizovaných těhotenství s rizikem fetální erytroblastózy.

Objective: Since ABI PRISM 7700 sequence detection system has not already been commercially available, quite a number of laboratories are obliged to perform actual non-invasive prenatal diagnosis from maternal peripheral blood on new equipment. The purpose of this study was to test the usage of 7300 real-time PCR system for the purpose of routine non-invasive fetal sex determination and fetal RHD and RHCE genotyping. Settings: Cell Biology Laboratory, Paediatric Clinic, 2nd Medical Faculty and University Hospital Motol Prague. Material and Methods: We evaluated paternal allele amplification on extracellular DNA isolated from maternal peripheral blood by using QIAamp DSP Virus kit (c and E alleles of RHCE gene) and QIAamp DNA Blood Mini kit (SRY, RHD and C allele of RHCE gene) in a cohort of 22 pregnant women within 10th and 38th week of pregnancy. Results: The results of fetal SRY (n = 6), RHD (exon 7 and exon 10, n = 7) and RHCE (C allele, n = 3; c allele, n = 3; E allele, n = 3) genotyping performed on 7300 real-time PCR system corresponded to sex and/or Rh phenotype of the foetus or the newborn in all tested pregnant women. We showed that 7300 real-time PCR system is sensitive enough for paternal allele detection performed on fetal DNA fraction within extracellular DNA isolated from maternal plasma. Conclusion: After ABI PRISM 7700 sequence detection system would be completely taken out of service, we would be able henceforth to provide reliable non-invasive fetal sex determination in pregnancies at risk of X-linked disorders and non-invasive fetal RHD and RHCE genotyping in alloimmunized pregnancies at risk of haemolytic disease of newborn.

• MeSH
• amplifikace genu fyziologie   genetika   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• geny sry fyziologie   genetika   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   trendy   využití   MeSH
• procesy určující pohlaví MeSH
• sekvenční analýza DNA metody   využití   MeSH
• těhotenství genetika   krev   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství genetika   krev   MeSH