Chronická B-lymfocytová leukémia (B-CLL) je jedna z najčastejších chorôb lymfatického systému u dospelých pacientov. Je známa rôznorodým klinickým priebehom – od benígnych až po infaustné formy. Pre spresnenie diagnózy a určenie správnej terapie sú potrebné spoľahlivé prognostické markery. Perspektívnym sa ukázal byť proteín ZAP-70, ktorý môže byť vo zvýšenej miere exprimovaný leukemickými bunkami pacientov s B-CLL. Dáva sa do súvisu s horšou prognózou pacienta vyžadujúcou intenzívnejšiu terapiu už v začiatočných štádiách. Základ prezentovanej štúdie tvorilo 20 prípadov biopsií kostnej drene od pacientov s diagnostikovanou B-CLL a 20 kontrolných prípadov bez nádorovej transformácie. Pri spracovaní materiálu bol okrem štandardnej imunohistochemickej metódy využitý aj amplifikačný systém (firmy DakoCytomation©). Výsledok bol hodnotený semikvantitatívne; ako negatívny (menej ako 5 % pozitívnych leukemických buniek), pozitívny (viac ako 30 % pozitívnych leukemických buniek) a nepravidelne pozitívny (medzi 5 % a 30 % pozitívnych leukemických buniek) a následne korelovaný s klinickým hodnotením prognózy pacienta. Výsledok pozitivity bol kontrolovaný aj morfometrickou analýzou, určením plochy pozitivity markera ZAP-70 voči celkovej ploche jadier v preparáte. V kontrolných prípadoch bola pozorovaná pozitivita markera ZAP-70 viazaná čisto na T-lymfocytov. Miera jadrovej pozitivity proteínu ZAP-70 pozorovaná v transformovaných B-lymfocytoch vykazovala signifikantnú súvislosť s horšou klinickou prognózou pacienta v prípadoch ak bola hodnotená ako jednoznačne pozitívna, resp. negatívna pri oboch spôsoboch spracovania preparátu. Prípady s nepravidelnou pozitivitou nevykazovali jednoznačnú klinickú koreláciu. Použitie amplifikačného systému s možnosťou využiť nižšiu koncentráciu primárnej protilátky a potlačiť pozitivitu pozadia, zvýšilo kontrast nálezu a redukovalo počet prípadov s hodnotenou nepravidelnou pozitivitou z 30 % (pri bežnom imunohistochemickom spracovaní) na 10?%. Možno konštatovať, že ZAP-70 predstavuje hodnotný prognostický marker chronickej B-lymfocytovej leukémie. Jeho hodnotenie pomocou imunohistochémie je vhodnou metódou pre klinickú prax. Problematickým sa však stáva hodnotenie hranične a nepravidelne pozitívnych prípadov, pri ktorých môže byť nápomocným využitie histochemického amplifikačného systému. Minimalizácia výskytu falošnej pozitivity, resp. negativity vyžaduje striktné kritériá pri hodnotení nálezu.

Chronic B-lymphocytic leukemia (B-CLL) is one of the most frequent diseases of the lymphatic system in adults. It is known for its variable course – from benign to prospectless forms. Reliable prognostic markers are needed to precify the diagnosis and the correct therapy. The ZAP-70 protein, as a prospective marker, can be highly expressed in leukemic cells of B-CLL patients. It is related to a worse prognosis requiring intense therapy from the beginning. The present study includes 20 cases of bone marrow trephine biopsy from patients with diagnosed B-CLL and 20 control cases without neoplastic infiltration. The specimens were investigated with standard immunohistochemical technique and with the use of the amplification system (DakoCytomation©). The results were evaluated semiquantitatively as negative (less than 5 %), positive (above 30 %), and irregularly positive (5–30 % of positive leukemic cells) and consecutively correlated with clinical evaluation of prognosis of the patient. The evaluation of the positivity was controlled also by morphometric analysis by determination of the area of ZAP-70 positivity related to the whole area of nuclei in the section. In the control specimens the ZAP-70 positivity was restricted to T-lymphocytes only. The level of the nuclear positivity of ZAP-70 protein detected in transformed B-lymphocytes showed significant correlation with the worse or the better clinical prognosis, respectively. Cases with irregular positivity did not show unambiguous clinical correlation. The use of the amplification system allowed to apply lower concentration of the primary antibody, reduction of background staining and increased the contrast of the findings leading to reduction of irregularly positive cases from 30 % (with routine histochemistry) to 10 %. It can be concluded that ZAP-70 represents a valuable prognostic marker for the chronic B-lymphocytic leukemia. Its evaluation by histochemistry is a suitable method for clinical praxis. Problematic may be the evaluation of borderline irregularly positive cases, in which the use of the histochemical amplification system is helpful. Strictly determined criteria are needed for limitation of inaccurate interpretation of the results.

• MeSH
• chronická lymfatická leukemie diagnóza   krev   MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   využití   MeSH
• financování organizované MeSH
• imunohistochemie metody   využití   MeSH
• lidé MeSH
• mikroskopie metody   využití   MeSH
• nádorové biomarkery izolace a purifikace   krev   MeSH
• nádorové proteiny izolace a purifikace   krev   MeSH
• prognóza MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 izolace a purifikace   krev   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

Zeta-associated protein of 70 kDa (ZAP-70) is a tyrosine kinase that plays a role in signal transduction from the T-cell receptor. ZAP-70 is expressed in normal T-cells and NK-cells. Increased expression of ZAP-70 has been identified in chronic lymphocytic leukemia (CLL). CLL patients with increased ZAP-70 expression have significantly worse prognosis in terms of both progression-free survival and overall survival. There are several methods to quantify ZAP-70: polymerase chain reaction (PCR), immunoblotting, immunohistochemistry, and flow cytometry. Use of flow cytometry for ZAP-70 detection seems to be advantageous as this technique enables us to assess the presence of ZAP-70 separately on CLL clone, T-cells, and NK-cells. On the other hand, detection of ZAP-70 by flow cytometry is substantially influenced by many variables. The principal drawback of flow cytometry is the absence of consensus regarding selection of optimal anti-ZAP-70 antibody, fluorochrome conjugate, the most reliable staining technique, and optimal positivity threshold. This article summarizes pitfalls of flow cytometric analysis of ZAP-70 in CLL.

• MeSH
• buňky NK imunologie   metabolismus   patologie   MeSH
• chronická lymfatická leukemie metabolismus   mortalita   patologie   MeSH
• lidé MeSH
• míra přežití MeSH
• nádorové proteiny biosyntéza   imunologie   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• přežití bez známek nemoci MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 biosyntéza   imunologie   MeSH
• průtoková cytometrie metody   MeSH
• receptory antigenů T-buněk imunologie   metabolismus   MeSH
• regulace genové exprese u leukemie * MeSH
• signální transdukce MeSH
• T-lymfocyty imunologie   metabolismus   patologie   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• přehledy MeSH

• MeSH
• chronická nemoc MeSH
• exprese genu MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• imunohistochemie metody   MeSH
• lidé MeSH
• lymfoidní leukemie diagnóza   genetika   MeSH
• metylace MeSH
• nádorové biomarkery MeSH
• nádorové proteiny genetika   MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• průtoková cytometrie MeSH
• somatická hypermutace imunoglobulinových genů genetika   MeSH
• western blotting MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• klinické zkoušky MeSH

INTRODUCTION: It is widely accepted that expression of ZAP-70 in chronic lymphocytic leukemia (CLL) remains stable in time. However, data supporting this notion are surprisingly scarce. Therefore, we assessed expression of ZAP-70 in serial samples taken during the course of the disease. PATIENTS AND METHODS: We studied 44 patients with CLL diagnosed according to NCI-WG criteria (34 men, 10 women, median age 62, range, 36-81). A total of 104 samples were examined; all patients had at least two measurements. Median interval between the first and the second sample was 13 months (range, 2-36). ZAP-70 expression was detected by flow cytometry using phycoerythrin-conjugated monoclonal antibody clone 1E7.2 and negative isotype control. Twenty percent of positive cells were considered as the threshold of positivity. RESULTS: Significant change in ZAP-70 expression (i.e. from positivity to negativity and vice versa) was detected in 15/44 patients (34%). Interestingly, 7/8 patients whose ZAP-70 expression converted to positivity had unmutated IgVH genes. In addition, the conversion was accompanied by clinical progression or relapse in all but one patient. On the other hand, 5/7 patients with loss of ZAP-70 had stable clinical course. One patient became ZAP-70-negative during treatment with prednisone for autoimmune hemolytic anemia. CONCLUSIONS: In contrast to commonly accepted opinion, significant change in ZAP-70 expression in time was detected in a substantial proportion of our patients with CLL. While the conversion to ZAP-70 negativity was found predominantly in patients with stable disease, change to positivity was typical in patients with unmutated IgVH genes at the time of progression or relapse. Based on our pilot results, repeated assessment of ZAP-70 expression might be especially useful at the time of progression or relapse in patients who were initially ZAP-70-negative.

• MeSH
• chronická lymfatická leukemie enzymologie   etiologie   MeSH
• dospělí MeSH
• geny pro těžké řetězce imunoglobulinů MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mutace MeSH
• nádorové biomarkery krev   MeSH
• pilotní projekty MeSH
• progrese nemoci MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 krev   MeSH
• recidiva MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Expression of ZAP-70 measured by flow cytometry belongs to the most powerful prognostic parameters in chronic lymphocytic leukemia (CLL). However, many technical factors such as setting of the positivity threshold may significantly influence results.. Quantification using mean fluorescent intensity (MFI) may eliminate the subjective error which is inevitable in the isotype control method. The aim of the present project was therefore to assess the prognostic significance of ZAP-70 using three different methods. Between 2005 and 2010 we measured ZAP-70 expression in 157 patients with CLL (108 males, 49 females, median age 60 years [range, 31-82]; low/intermediate/high Rai risk in 41/48/11%). Expression of ZAP-70 was determined by flow cytometry using phycoerythrin (PE)-conjugated monoclonal antibody, clone 1E7.2. Evaluation was performed by 1) percentage of positive cells compared to isotype control (cut-off 20%), 2) MFI ratio of T-cells/CLL cells (cut-off 3.0); 3) MFI ratio of ZAP-70/isotype control on CLL cells (cut-off 2.5). MFI method with T-cells/CLL cells ratio was the best in the identification of patients with unfavourable outcome: ZAP-70 positive patients had significantly shorter time to treatment (TTT, median 24 vs. 55 months, p=0.0001) and overall survival (OS, median 97 vs 174 months, p=0.0074). The differences in TTT a OS were not significant with the use of isotype percentage and MFI isotype methods. Combined analysis of ZAP-70 with CD38 expression or IgVH mutation status lead to identification of a subgroup with the longest TTT and OS (ZAP-70 and CD38 negative, p<0.0001 and p=0.012; ZAP-70 negative and mutated IgVH genes, p<0.0001 and p=0.0019). In conclusion, our results suggest that measurement of ZAP-70 expression in CLL by MFI using T-cells/CLL cells ratio might be the optimal method for accurate prediction of clinical course. Combined analysis of ZAP-70 with CD38 or IgVH mutation status further refined individual patient´s prognosis.

• MeSH
• chronická lymfatická leukemie imunologie   metabolismus   mortalita   MeSH
• dospělí MeSH
• fluorescence MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• počet lymfocytů MeSH
• prognóza MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 analýza   MeSH
• průtoková cytometrie MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

• MeSH
• biologické markery krev   MeSH
• chronická lymfatická leukemie * genetika   krev   MeSH
• geny pro těžké řetězce imunoglobulinů genetika   MeSH
• lidé MeSH
• mutace MeSH
• prognóza MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 * genetika   metabolismus   MeSH
• regulace genové exprese u leukemie * genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• dopisy MeSH
• komentáře MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Although signal transduction by immunoreceptors such as the T cell antigen receptor (TCR), B cell antigen receptor (BCR), and Fc receptors uses the same schematic and similar molecules, the threshold and the fine-tuning are set differently for each receptor. One manifestation of these differences is that inhibition of Src family kinases (SFK) blocks TCR but not BCR signaling. SFKs are key kinases phosphorylating immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAM) in both these receptors. However, it has been proposed that in B cells, downstream kinase SYK can phosphorylate ITAM sequences independently of SFK, allowing it to compensate for the loss of SFK activity, whereas its T cell paralog ZAP-70 is not capable of this compensation. To test this proposal, we examined signaling in SYK- and ZAP-70-deficient B and T cell lines expressing SYK or ZAP-70. We also analyzed signal transduction in T cells expressing BCR or B cells expressing part of the TCR complex. We show that when compared with ZAP-70, SYK lowered the threshold for SFK activity necessary to initiate antigen receptor signaling in both T and B cells. However, neither SYK nor ZAP-70 were able to initiate signaling independently of SFK. We further found that additional important factors are involved in setting this threshold. These include differences between the antigen receptor complexes themselves and the spatial separation of the key transmembrane adaptor protein LAT from the TCR. Thus, immunoreceptor sensing of SFK activity is a complex process regulated at multiple levels.

• MeSH
• B-lymfocyty metabolismus   MeSH
• Jurkat buňky MeSH
• kinasa Syk genetika   metabolismus   MeSH
• lidé MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 genetika   metabolismus   MeSH
• receptory antigenů B-buněk genetika   metabolismus   MeSH
• receptory antigenů T-buněk genetika   metabolismus   MeSH
• signální transdukce * MeSH
• skupina kinas odvozených od src-genu genetika   metabolismus   MeSH
• T-lymfocyty metabolismus   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Účel přehledu: V rozvoji alergického zánětu mají rozhodující úlohu aktivované žírné buňky, bazofily a CD4+ pomocné T‑lymfocyty. Odhalení možností specifického potlačení jejich aktivity by tedy umožnilo kontrolovat rozvoj a tíži alergického zánětu. V tomto článku shrnujeme současný přehled znalostí o úloze žírných buněk a bazofilů v procesu alergické odpovědi a regulace kontroly signálních drah spuštěných po vazbě antigenu na receptor pro IgE, který zahajuje aktivaci žírných buněk a bazofilů. Dále upozorňujeme na práce věnující se výzkumu úlohy proteinových tyrozinkináz Zap‑70 a Itk na vývoji imunitního systému a kontrole CD4+ pomocných T‑lymfocytů v procesu buněčné odpovědi. Nové poznatky: Předkládaná práce potvrzuje, že funkce žírné buňky se překvapivě liší od úlohy bazofilů, jejichž úloha je v Th2‑řízené imunitní odpovědi daleko významnější, než se dříve předpokládalo. Biochemická analýza signální dráhy spuštěné aktivací receptoru pro IgE nás vede k porozumění úloze fosfatáz a dalších enzymů podílejících se na procesu aktivace. Ke stanovení jejich významu přispěly práce zabývající se aktivitou tyrozinkináz Zap‑70 a Itk; autoři těchto prací také naznačují možnosti použití těchto enzymů k potlačení alergického zánětu i možné komplikace vyvolané útlumem jejich aktivity. Souhrn: Analýza geneticky upravených myší a biochemické studie nám postupně umožňují pochopit molekulární dráhy, které řídí alergickou zánětlivou odpověď. Získané poznatky by mohly sloužit jako podklad pro nové postupy potlačení alergického zánětu.

Activated mast cells, basophils, and CD4 helper T cells have critical roles in allergic inflammation. Therefore, devising ways to specifically inhibit these cells will likely be useful for controlling allergic inflammation. We summarize recent findings regarding the role of mast cells and basophils in allergic responses and the regulation of signaling pathways downstream of the IgE receptor, the chief inducer of mast cell and basophil activation. We also highlight studies addressing the roles of the protein tyrosine kinases Zap-70 and Itk in immune system development and in the regulation of CD4 helper T cell responses. RECENT FINDINGS: Recent work has demonstrated that mast cell function is unexpectedly diverse and that basophils have a more prominent role in Th2-type immune responses than previously appreciated. Biochemical analysis of the IgE receptor signaling pathway has led to insights regarding the roles of phosphatases and other enzymes in this process. Studies of Zap-70 and Itk have helped to define the potential outcomes and complications of inhibiting these enzymes in order to suppress allergic inflammation. SUMMARY: Analysis of genetically engineered mice and biochemical studies continue to help unravel the molecular pathways that drive allergic inflammatory reactions. The knowledge acquired may lead to novel approaches for suppressing allergic inflammation.

• MeSH
• alergie farmakoterapie   imunologie   MeSH
• bazofily imunologie   MeSH
• dýchací soustava imunologie   MeSH
• geneticky modifikovaná zvířata MeSH
• imunosupresivní léčba MeSH
• lidé MeSH
• mastocyty imunologie   MeSH
• myši MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 imunologie   metabolismus   MeSH
• receptory IgE metabolismus   MeSH
• signální transdukce MeSH
• Th2 buňky imunologie   MeSH
• tyrosinkinasové receptory imunologie   metabolismus   MeSH
• zánět MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• myši MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

The results of repeated interphase fluorescence in-situ hybridization (I-FISH, FISH) examination of 97 CLL patients and correlation of these findings with IgVH hypermutation status, ZAP-70 and CD38 expression are presented. The appearance of new, FISH-detectable, genomic aberrations during disease course, described as clonal evolution (CE), was observed in 26% of patients. The most frequent newly acquired cytogenetic abnormality was 13q deletion in 64% (16/25). In contrast to earlier studies, there was no correlation found between CE and either one of single negative prognostic factors (unmutated IgVH; CD38 positivity; ZAP-70 positivity). However, the combination of all three negative factors correlated with CE highly significantly (p=0.005) and moreover, also with a shift from lower to higher FISH risk category (p=0.010). As the prognostic data were known in all patients, this study represents the complete insight on the association of CE and other risk parameters in CLL.

• MeSH
• antigeny CD38 analýza   MeSH
• chromozomální aberace MeSH
• chronická lymfatická leukemie genetika   MeSH
• dospělí MeSH
• hybridizace in situ fluorescenční metody   MeSH
• interfáze MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 analýza   MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Self-non-self discrimination is central to T cell-mediated immunity. The kinetic proofreading model can explain T cell antigen receptor (TCR) ligand discrimination; however, the rate-limiting steps have not been identified. Here, we show that tyrosine phosphorylation of the T cell adapter protein LAT at position Y132 is a critical kinetic bottleneck for ligand discrimination. LAT phosphorylation at Y132, mediated by the kinase ZAP-70, leads to the recruitment and activation of phospholipase C-γ1 (PLC-γ1), an important effector molecule for T cell activation. The slow phosphorylation of Y132, relative to other phosphosites on LAT, is governed by a preceding glycine residue (G131) but can be accelerated by substituting this glycine with aspartate or glutamate. Acceleration of Y132 phosphorylation increases the speed and magnitude of PLC-γ1 activation and enhances T cell sensitivity to weaker stimuli, including weak agonists and self-peptides. These observations suggest that the slow phosphorylation of Y132 acts as a proofreading step to facilitate T cell ligand discrimination.

• MeSH
• adaptorové proteiny signální transdukční imunologie   metabolismus   MeSH
• aktivace lymfocytů * MeSH
• fosfolipasa C gama metabolismus   MeSH
• fosforylace imunologie   MeSH
• ligandy MeSH
• membránové proteiny imunologie   metabolismus   MeSH
• myši MeSH
• protein-tyrosinkináza ZAP-70 metabolismus   MeSH
• receptory antigenů T-buněk imunologie   metabolismus   MeSH
• T-lymfocyty imunologie   metabolismus   MeSH
• tyrosin metabolismus   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• mužské pohlaví MeSH
• myši MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• Research Support, N.I.H., Extramural MeSH