fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
Dotaz
Zobrazit nápovědu
Východisko. Pouze asi 50 % žen s Turnerovým syndromem má podle literárních údajů karyotyp 45,X ve všech buňkách, ostatní mají mozaiky dvou nebo více buněčných klonů. S rozvojem nových metod se však ukazuje, že nemocných s mozaikami je pravděpodobně více, než se předpokládalo na základě klasických cytogenetických vyšetření. Cílem práce bylo sledovat početní odchylky chromozomu X v mitózách i v jádrech kultivovaných periferních lymfocytů žen s Turnerovým syndromem metodou FISH, určit rozdíly v citlivosti klasických a molekulárně cyto- genetických metod u těchto pacientek a porovnat je s kontrolní skupinou zdravých žen. Metody a výsledky. Vyšetřili jsme 18 žen s Turnerovým syndromem. Klasickou cytogenetickou analýzou jsme u 9 pacientek prokázali karyotyp 45,X ve všech hodnocených buňkách a u dalších 9 žen jsme nalezli mozaiku dvou nebo více buněčných klonů. Cytogenetické nálezy jsme porovnali s výsledky analýzy mitóz a interfázních buněk metodou FISH s a-satelitními sondami. Ve všech případech FISH potvrdila cytogenetické výsledky a kromě toho u 6 žen (30 %) prokázala existenci nových buněčných klonů, které nebyly zachyceny klasickou cytogenetikou. Závěry. Prokázali jsme vhodnost použití metody FISH při detekci mozaicismu u nemocných s Turnerovým syndromem. FISH díky vyšší senzitivitě umožňuje zachytit větší počet mozaikových linií než klasická cytogenetika.
Background. According to the literature approximately 50% of patients with Turner's syndrome have karyotype 45,X in every cell, the rest have two or more cell lines with mosaics of sex chromosomes. New methods have shown that the mosaicism is probably more frequent than expected from classical cytogenetics examinations. The aim of this study was to detect numerical changes of sex chromosomes in mitoses and interphase nuclei of cultivated peripheral lymphocytes of patients with Turner's syndrome by means of FISH, to compare the sensitivity of classical and molecular-cytogenetic methods and to estimate the values obtained in 10 control healthy females with karyotype 46,XX. Methods and Results. 18 females with Turner's syndrome were examined. Karyotype 45,X was found by classical cytogenetics in all cells of 9 females. The 9 remaining patients had sex chromosome mosaicism of two or more clones. In all patients FISH confirmed the results of classical cytogenetic methods and in 6 patients (30%) it revealed other clones previously not detected. Conclusions. Higher sensitivity of FISH enables more precise detection of mosaicism of cell lines than classical cytogenetics and this technique is more suitable for examinations of patients with Turner' syndrome.
Existuje několik metod, které umožňují analyzovat celý genom a hledat změny v počtu, struktuře a expresi genů a DNA sekvencí. Z technik molekulární cytogenetiky to jsou komparativní genomová hybridizace (CGH), spektrální karyotypování (SKY) a metoda mnohobarevné fluorescenční in situ hybridizace (mFISH). Uvádíme přehledně princip těchto metod, možnosti jejich využití v klinických a výzkumných laboratořích a naše vlastní zkušenosti s metodou mFISH při jejím zavádění v cytogenetické laboratoři, při analýze získaných komplexních chromozomových přestaveb v nádorových buňkách a identifikaci vrozeného marker chromozómu. Dále jsme tento přehled doplnili popisem zcela nové molekulárně cytogenetické metody mnohobarevného pruhování chromozómů s vysokou rozlišovací schopností (mBAND). Tato metoda je založena na podobném principu jako mFISH s tím rozdílem, že vychází z použití tzv. parciálních malovacích sond, které hybridizují ke specifickým oblastem jednotlivých chromozómů. S její pomocí tedy analyzujeme jen jeden konkrétní chromozóm. V našem sledování je to chromozóm č. 5. Metodou mBAND získáme mnohobarevné pruhy vydělující jednotlivé oblasti dlouhých i krátkých ramen a může sloužit k přesné lokalizace zlomových míst. Uvádíme jednu nemocnou s myelodysplastickým syndromem (MDS) a netypickou intersticiální delecí dlouhých ramen chromozómu č. 5. Metody mFISH a mBAND mají velký význam a uplatnění v klinické i onkologické cytogenetice, protože přinesou další zpřesnění cytogenetické diagnostiky vrozených a získaných chromozómových změn.
Various techniques are now available for wide genome screening of alterations in copy number, structure and expression of genes and DNA sequences. Molecular cytogenetics has special techniques of comparative genomic hybridization (CGH), spectral karyotyping (SKY) and multicolor FISH (mFISH). We present principles of these methods, their use in molecular cytogenetic examinations of patients. We quote our experience with mFISH for analyses of complex chromosomal rearrangements in neoplastic cells and identification of inborn supernumerary marker chromosome. Further, we also review the first experiences with multicolor high resolution banding of chromosome (mBAND). This method was used for analysis of bone marrow cells of patient with myelodysplastic syndrome and deletion of chromosome No. 5. With mBAND exact breakpoints were localized. Multicolor fluorescence methods mFISH and mBAND becones the new tools for more precise analyses of inborn and acquired numerical and structural chromosomal rearrangements.
- MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
Východisko. Klasickým cytogenetickým vyšetřením buněk kostní dřeně nebo periferních B-lymfocytů bylo zjištěno, že nejčastější změnou chromozómů u chronické lymfatické leukémie je trizómie 12. Molekulárně cytoge- netická metoda tzv. interfázická in situ hybridizace, kterou je možné vyšetřovat i nedělící se buňky, však dokázala, že chromozómových změn u CLL je daleko víc a že mají přímý vztah ke vzniku a průběhu onemocnění. Metody a výsledky. Během posledních dvou let vyšetřujeme buňky kostní dřeně nemocných s CLL kromě klasickou cytogenetickou metodou G-pruhováním také fluorescenční in situ hybridizací. Pomocí centromerické a-satelitní sondy pro chromozóm 12 sledujeme početní odchylky v dělících i nedělících se buňkách, dále kosmido- vými sondami hledáme drobné delece v oblasti 13q14 (Rb gen) a 17p13 (p53 protein). Tyto geny jsou zodpovědné za buněčné dělení a jsou dávány do přímé souvislosti se vznikem nádorových procesů. U CLL řešíme v současnosti otázku, zda početní (trizómie 12) a strukturní (delece) chromozómové změny jsou primární či sekundární změnou a jaký je jejich vztah k průběhu onemocnění. Sondou CEP12 jsme vyšetřili 93 nemocných, u 24 z nich (tj. 25,8 %) jsme zjistili existenci buněčného klonu s trizómií 12. Zastoupení klonu bylo 2,5-75,5 % buněk a klasickou cytogenetikou byla jeho existence prokázána jen u 2 nemocných. Delece v oblasti 13q14 byla prokázána sondou LSI D13S319 u 24 nemocných ze 73 (32,8 %), rozsah klonu 2,5-80,0 % buněk, klasickou cytogenetikou s potvrzením FISH byla delece 13q14 nalezena jen u 1 nemocného. Deleci 17p13 jsme u 61 pacientů vyšetřených sondou LSI p53 zjistili u 14 (22,9 %), a to vždy jen metodou FISH. Rozsah klonu 2,5-34,0 % buněk. Deleci del(11)(q23) jsme nezjistili u žádného z 12 vyšetřených pacientů. Všechny sondy jsou od firmy VYSIS™. Závěry. Interfázická FISH je velmi citlivou metodou, kterou lze u vysokého procenta pacientů s CLL prokázat chromozómové odchylky. Náš soubor nemocných s CLL dále rozšiřujeme a hledáme korelace mezi molekulárně- cytogenetickými, imunologickými, morfologickými a prognostickými ukazateli.
Background. Trisomy 12 was found to be the most frequent chromosomal aberration identified by conventional cytogenetic studies of bone marrow cells and peripheral lymphocytes of patients with CLL. Molecular-cytogenetic techniques which enable examination of dividing and/or non-diving interphase nuclei (I-FISH), proved existence of other chromosomal abnormalities, mainly deletions, which could have in CLL patients relation to the origin, course and prognosis of the disease. Methods and Results. During the last two years bone marrow chromosomes of all patients with CLL were examined by G-banding and by I-FISH. The numerical changes of chromosome 12 were followed by centromeric DNA probe in dividing and non-dividing cells. The small deletions were ascertained by locus specific probes for 13q14 (Rb gene), 17p13 (p53 protein) and 11q23 (MLL gene). These genes are responsible for cell division and their function is probably in connection with neoplastic process. It is of interest whether numerical and structural chromosomal rearrangements are primary or secondary changes and what is their impact on etiology of CLL. 93 patients were examined by DNA prove CEP12 and trisomy 12 was found in 24 of them (25.8 %), the range of the clone was 2.5-75.5 % of the screened cells. Deletion del(13)(q14) was examined by probe D13S319 in 73 patients and proved in 24 of them (32.8 %), pathological clone ranged 2.5-80.0 % of the cells. Deletion del(17)(p13) was found in 14 patients out of 61 examined by probe LSI p53 (22.9 %). The extent of the clone was 2.5-34.0 % of examined cells. Deletion 11q23 was not ascertained in any of 11 patients by means of probe LSI 11q23 (MLL). All probes used for FISH were manufactured by VYSIS™. Conclusions. FISH is very sensitive method, suitable for molecular-cytogenetic examination of leukemic patients. With I-FISH the deletion of 13q14 was ascertained as the most frequent chromosomal aberration in series of 73 patients with CLL. We continue to increase the number of patients screened by I-FISH with all eligible DNA probes and start the prospective study on patients with chromosomal pathology. We will correlate the immunophe- notype, morphology, clinical course and prognosis with karyotypic findings.
- MeSH
- B-lymfocyty genetika MeSH
- chronická nemoc MeSH
- delece genu MeSH
- DNA sondy diagnostické užití MeSH
- dospělí MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- lymfoidní leukemie diagnóza genetika MeSH
- prognóza MeSH
- senioři MeSH
- trizomie MeSH
- Check Tag
- dospělí MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- senioři MeSH
- ženské pohlaví MeSH
Přesná analýza karyotypu leukemických buněk hraje významnou roli při diagnostice, klasifikaci, stanovení prognózy a monitorování léčby nemocných s leukémiemi. U dětských ALL byla popsána řada specifických chro- mozómových aberací, které mají velký prognostický význam. K nejdůležitějším patří hyperdiploidie s více než 50 chromozómy a t(12;21), které jsou považovány za příznivý prognostický faktor a t(9;22) a přestavby MLL genu, které korelují se špatnou prognózou. Proto je včasná a přesná detekce těchto aberací velmi důležitá. Metody FISH překonávají některá omezení metod konvenční cytogenetiky a molekulární genetiky a díky své citlivosti umožňují detekovat specifické chromozómové aberace v mitózách i v nedělících se interfázních jádrech. K detekci hyperdi- ploidních buněčných klonů a strukturních přestaveb používáme dvoubarevnou fluorescenci s centromerickými, respektive lokus-specifickými sondami. K analýze složitých komplexních přestaveb používáme malovací sondy a mnohobarevnou fluorescenční in situ hybridizaci (mFISH). Během posledních 8 let jsme různými metodami vyšetřili celkem 275 dětí s ALL. Translokaci t(9;22) jsme nalezli u sedmi a přestavby MLL genu u 14 nemocných z tohoto souboru. Detekcí hyperdiploidních buněk a t(12;21) se zabýváme od roku 1988. Buňky s vysokou hyper- diploidií jsme detekovali u 35 pacientů, 10 z nich mělo v karyotypu další komplexní přestavby. Translokaci t(12;21) jsme detekovali u 37 nemocných a komplexní přestavby jsme prokázali u 22 z nich. FISH se spolu s cytogenetikou a molekulární genetikou stala v dnešní době nezbytnou součástí laboratorních vyšetření u dětí s ALL, a to nejen při diagnostice, ale i v průběhu léčby.
Classical cytogenetic analysis plays an important role in the diagnosis, classificat ion, therapy monitoring and prognosis of patients with leukemia. Many recurrent cytogenetic abnormalities with major prognostic values have been described in childhood ALL. Hyperdiploidy and/or t(12;21) are associated with good prognosis, whereas t(9;22) and/or rearrangements of MLL gene correlate with poor outcome and therefore early detection of these abnormalities is very important. FISH can overcome some limitations of conventional cytogenetic and molecular-genetic analyses and due to high sensitivity specific chromosomal aberrations in mitoses and/or interphase nuclei can be detected. In the Center of Oncocytogenetics of the 3rd Medical Department for assesment of hyperdiploidy and structural rearrangements we use double-color FISH with centromeric and/or locus-specific probes and complex aberrations are ascertained by whole chromosome painting probes and multicolor FISH. Among 275 children with ALL examined during the last 8 years by different FISH methods we found seven patients with translocation t(9;22) and 14 patients with MLL rearrangements in bone marrow cells. Since 1988 we focus on detection of hyperdiploidy and/or t(12;21). High hyperdiploidy was found in 35 children, 10 of them had further complex rearrangements. Translocation t(12;21) was proved in 37 patients and complex rearrangements were found in 22 of them. FISH, cytogenetic and molecular-genetic analyses become obligatory for the first diagnostic examination as well as for monitoring of treatment effect in children with ALL.
- MeSH
- akutní lymfatická leukemie diagnóza MeSH
- chromozomální aberace MeSH
- cytogenetické vyšetření metody MeSH
- dítě MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- genová přestavba MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční metody MeSH
- lidé MeSH
- prognóza MeSH
- translokace genetická MeSH
- Check Tag
- dítě MeSH
- lidé MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
Cíl studie: Seznámení čtenáře s problematikou preimplantační genetické diagnostiky a souboremlaboratorních postupů při odběru, úpravě a vyšetření pólových tělísek, spermií a embryí metodoufluorescenční in situ hybridizace (FISH) v programu fertilizace in vitro.Typ studie: Přehled.Název a sídlo pracoviště: Sanatorium REPROMEDA, Brno, Výzkumný ústav veterinárního lékařstvíBrno.Metodika: Stručný a výstižný přehled postupů při získání materiálu, přípravě vyšetřovaného vzorkua průběhu vyšetření chromosomů metodami FISH.Závěry: Práce přehledně zpracovává problematiku provedení PGD, zejména vyšetření chromosomálníchaneuploidií včetně metodiky odběru materiálu, přípravy k vlastní analýze FISH a provedenítéto analýzy.
Objective: Presentation of preimplantation genetic diagnosis and the set of laboratory processes likeaspiration, preparation and evaluation of polar bodies, sperm cells and blastomeres using FISHmethod (fluorescent in situ hybridization) in ART.Design: Review.Setting: Sanatorium REPROMEDA, Brno, Veterinary Research Institute, Brno.Methods: Overview of published data and own clinical experience with the cell aspiration methods,evaluated sample preparation and the proper chromosomes visualisation using FISH method.Conclusion: The review brings an overview of conditions and methods including sample obtaining,FISH analysis preparation and implementation, processed during PGD.
- MeSH
- blastomery MeSH
- dospělí MeSH
- fertilizace in vitro MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční MeSH
- lidé MeSH
- odběr biologického vzorku MeSH
- oocyty MeSH
- preimplantační diagnóza metody MeSH
- spermie MeSH
- Check Tag
- dospělí MeSH
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
Duchenneova a Beckerova svalová dystrofie (DMD/BMD) jsou na X chromosom vázaná recesivně dědičná onemocnění způsobená mutacemi v genu, který kóduje protein dystrofiu. U približně 65 % pacientů postižených DMD a BMD se zjistí velká intragenová delece v dystrofínovém genu. Matky postižených chlapců jsou asi ve dvou třetinách případů přenašečkami prislušné mutace v dystrofínovém genu. U postižených probandů se detekce delecí v dystrofínovém genu rutinně provádí metodami vícenásobné polymerázové řetězové reakce (mPCR), RT-PCR (reverzně transkriptázové PCR) s testem na zkrácený protein (PTT - protein truncation test) či Southern blottingem. Detekce delecí u přenašeček je komplikována přítomností kopie genu pro dystrofiu na druhém chromosomu X. V naší studii prezentujeme diagnostickou strategii, která využívá metodu fluorescenční in situ hybridizace (FISH) pro detekci přenašeček DMD/BMD. Použili jsme set šesti kosmidových prob na detekci nejčastěji deletovaných oblastí dystrofínového genu získaných z oddělení lékařské genetiky Leidenské Univerzity (Department of Human Genetics, Leiden University Medical Center). Vyšetřili jsme 14 matek probandů, u nichž byla metodou mPCR nebo RT-PCR/PTT zjištěna a definována delece v dystrofinovém genu. Ve 4 případech byla matka postiženého probanda identifikována jako přenašečka delece v dystrofínovém genu. U čtyř zdravých žen kontrolní skupiny jsme neprokázali delece ve vyšetřovaných exonech. Žádný ze získaných výsledků nebyl v rozporu s výsledky mPCR či RT-PCR/PTT. Na základě našich výsledků jsme tíospěli k závěru, že fluorescenční in situ hybridizace je efektivní a přímou metodou pro identifíkaci přenašeček delecí v dystrofínovém genu a navrhujeme ji jako metodu první volby v diagnostice přenašeček DMD/BMD.
Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD/BMD) are X-linked recessive disorders caused by mutations in the dystrophin gene. A large intragenic deletion has been described in about 65% of DMD/BMD patients. Mothers of affected males are DMD/BMD carriers in two thirds of the cases. Routine deletions detection in DMD/BMD males is performed using multiplex polymerase chain reaction (mPCR), RT-PCR with a protein truncation test (PTT) or using Southern blotting. In females the deletions detection is complicated by the presence of a normal gene copy on the second X-chromosome. We are presenting the diagnostic strategy using FISH for the deletions detection in the dystrophin gene of female DMD/BMD carriers. We have used a set of six cosmid probes for the detection of the most ft-equently deleted areas of the dystrophin gene from the Department of Human Genetics, Leiden University Medical Center. We have examined 14 mothers of DMD/BMD males with a deletion in the dystrophin gene identifíed using mPCR. Four mothers of affected males have been diagnosed as carriers of a deletion in the dystrophin gene. We have revealed no deletion mutations in the exons examined in a control group of four healthy females. No discrepancy has been found between the FISH analysis residts and the results of mPCR. Our results indicate that FISH is an effective and direct method for the identification of DMD/BMD carriers and we suggest this method as a method of a first choice in the identification of DMD/BMD carriers.
Metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH) umožňuje stanovit frekvenci chromozomálně abnormálních spermií v ejakulátu. V minulosti byly publikovány základní hladiny disomií pro jednotlivé chromozomy (0,03–0,47 %) zjištěné metodou FISH ve spermiích normálních zdravých dárců. Celkově je u zdravých mužů asi 7 % spermií chromozomálně abnormálních, nejčastější jsou aneuploidie chromozomů 21, X a Y. Byla však zaznamenána významná individuální variabilita. Vyšší frekvence numerických aberací se často nacházejí v ejakulátu mužů s abnormálním spermiogramem, u nositelů vrozených chromozomálních abnormalit (numerické aberace pohlavních chromozomů, marker chromozomy, balancované translokace a inverze) a ve spermiích získaných TESE. Největší přínos má vyšetření spermií metodou FISH pro nositele vrozených reciprokých a Robertsonových translokací, příp. pericentrických inverzí. Publikované frekvence chromozomálně nebalancovaných spermií se pohybují v rozmezí 0–37 % u nositelů pericentrických inverzí, 3–40 % u nositelů Robertsonových translokací a až 23–81 % u nositelů reciprokých translokací. Stanovení frekvence chromozomálně abnormálních spermií umožňuje individualizaci rizika u jednotlivých pacientů, informované rozhodování páru při plánování rodičovství a predikci úspěšnosti IVF cyklu.
The fluorescence in situ hybridization (FISH) method allows detection of frequencies of chromosomally abnormal spermatozoa in semen. Baseline levels of disomies for different chromosomes (0.03–0.47%) detected by FISH method in sperm from normal healthy donors have previously been published. Semen of healthy men usually contains approximately 7% of chromosomally abnormal spermatozoa, with aneuploidies of chromosomes 21, X and Y being the most frequent. However, a significant inter-individual variability was observed. Higher frequencies of numerical aberrations are often found in men with abnormal semen characteristics, in carriers of congenital chromosomal abnormalities (numerical sex chromosome aberrations, marker chromosomes, balanced translocations and inversions) and in sperm obtained by TESE. Sperm evaluation by the FISH method is of benefit especially for carriers of congenital reciprocal and Robertsonian translocations, or of some pericentric inversions. Published frequencies of chromosomally unbalanced sperm range from 0–37% in carriers of pericentric inversions, 3–40% in carriers of Robertsonian translocations and even 23–81% in carriers of reciprocal translocations. Assessment of frequencies of chromosomally abnormal spermatozoa allows personalized risk estimation in individual patients, making informed decisions concerning family planning and the prediction of IVF cycle outcome.
