Fluorescent in situ hybridization
Dotaz
Zobrazit nápovědu
Existuje několik metod, které umožňují analyzovat celý genom a hledat změny v počtu, struktuře a expresi genů a DNA sekvencí. Z technik molekulární cytogenetiky to jsou komparativní genomová hybridizace (CGH), spektrální karyotypování (SKY) a metoda mnohobarevné fluorescenční in situ hybridizace (mFISH). Uvádíme přehledně princip těchto metod, možnosti jejich využití v klinických a výzkumných laboratořích a naše vlastní zkušenosti s metodou mFISH při jejím zavádění v cytogenetické laboratoři, při analýze získaných komplexních chromozomových přestaveb v nádorových buňkách a identifikaci vrozeného marker chromozómu. Dále jsme tento přehled doplnili popisem zcela nové molekulárně cytogenetické metody mnohobarevného pruhování chromozómů s vysokou rozlišovací schopností (mBAND). Tato metoda je založena na podobném principu jako mFISH s tím rozdílem, že vychází z použití tzv. parciálních malovacích sond, které hybridizují ke specifickým oblastem jednotlivých chromozómů. S její pomocí tedy analyzujeme jen jeden konkrétní chromozóm. V našem sledování je to chromozóm č. 5. Metodou mBAND získáme mnohobarevné pruhy vydělující jednotlivé oblasti dlouhých i krátkých ramen a může sloužit k přesné lokalizace zlomových míst. Uvádíme jednu nemocnou s myelodysplastickým syndromem (MDS) a netypickou intersticiální delecí dlouhých ramen chromozómu č. 5. Metody mFISH a mBAND mají velký význam a uplatnění v klinické i onkologické cytogenetice, protože přinesou další zpřesnění cytogenetické diagnostiky vrozených a získaných chromozómových změn.
Various techniques are now available for wide genome screening of alterations in copy number, structure and expression of genes and DNA sequences. Molecular cytogenetics has special techniques of comparative genomic hybridization (CGH), spectral karyotyping (SKY) and multicolor FISH (mFISH). We present principles of these methods, their use in molecular cytogenetic examinations of patients. We quote our experience with mFISH for analyses of complex chromosomal rearrangements in neoplastic cells and identification of inborn supernumerary marker chromosome. Further, we also review the first experiences with multicolor high resolution banding of chromosome (mBAND). This method was used for analysis of bone marrow cells of patient with myelodysplastic syndrome and deletion of chromosome No. 5. With mBAND exact breakpoints were localized. Multicolor fluorescence methods mFISH and mBAND becones the new tools for more precise analyses of inborn and acquired numerical and structural chromosomal rearrangements.
- MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
Metoda I-FISH (fluorescenční in situ hybridizace na jádrech v interfázi) propojuje morfologické vyšetření histologických řezů z formolem fixovaných a do parafinu zalitých tkání s molekulárními technikami, které využívají sekvenční specifičnosti bází nukleových kyselin pro určitý lokus (oblast na chromozomu). I-FISH je poměrně nenáročná na laboratorní provedení a přitom poskytuje celou řadu důležitých informací o vyšetřovaných buňkách. V rámci pracovišť patologie je využívána především v diagnostice nádorů. I-FISH umožňuje detekovat počty kopií genů (amplifikace či delece), počty jednotlivých chromozomů (polyzomie či monozomie), chromozomální zlomy a translokace a další změny. V současné době se I-FISH používá nejen pro stanovení diagnózy onemocnění nebo k odhadu prognózy nemocných, ale i k indikaci cílené terapie nádorů. Protože se zvyšují nároky na vyšetřování solidních nádorů, stává se metoda I-FISH prakticky rutinním vyšetřením. Článek shrnuje princip a využití I-FISH a snaží se usnadnit základní orientaci v této problematice. Klíčová slova: fluorescenční in situ hybridizace – histologický řez – fluorescenční mikroskop – sonda – interfázická jádra – fixace formaldehydem
I-FISH (fluorescence in situ hybridization on interphasic nuclei) represents a laboratory method linking morphological investigations (histological sections of formaldehyde fixed and paraffin embedded tissues) with molecular techniques (sequence specificity of nucleic acids bases for a certain locus). I-FISH is relatively undemanding for a laboratory workout, but offering a lot of important information about the investigated cells. Within a scope of pathology departments I-FISH is utilized mostly in diagnostics of neoplasms. I-FISH is helpful in detecting gene copy numbers (amplifications or deletions), and, importantly, in establishing copy numbers of individual chromosomes (polysomies or monosomies), chromosomal breaks and translocations. At present, I-FISH is used not only for diagnosis and estimation of prognosis, but also as a method to qualify a patient for a targeted biological therapy. Because demands on investigation of solid tumors keep raising I-FISH becomes a part of routine investigations. The aim of this paper is to summarize principles and the utility of I-FISH and to help the interested readers in finding a basic orientation in this laboratory method. Keywords: fluorescence in situ hybridization – histological section – fluorescence microscope – probe – interphasic nuclei – formaldehyde fixation
- Klíčová slova
- histologický řez, interfázická jádra, fluorescenční mikroskop,
- MeSH
- amplifikace genu MeSH
- DNA sondy MeSH
- fluorescenční barviva diagnostické užití MeSH
- fluorescenční mikroskopie * metody přístrojové vybavení MeSH
- formaldehyd diagnostické užití MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční * metody přístrojové vybavení MeSH
- interfáze MeSH
- lidé MeSH
- nádory * diagnóza genetika patologie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
Metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH) umožňuje stanovit frekvenci chromozomálně abnormálních spermií v ejakulátu. V minulosti byly publikovány základní hladiny disomií pro jednotlivé chromozomy (0,03–0,47 %) zjištěné metodou FISH ve spermiích normálních zdravých dárců. Celkově je u zdravých mužů asi 7 % spermií chromozomálně abnormálních, nejčastější jsou aneuploidie chromozomů 21, X a Y. Byla však zaznamenána významná individuální variabilita. Vyšší frekvence numerických aberací se často nacházejí v ejakulátu mužů s abnormálním spermiogramem, u nositelů vrozených chromozomálních abnormalit (numerické aberace pohlavních chromozomů, marker chromozomy, balancované translokace a inverze) a ve spermiích získaných TESE. Největší přínos má vyšetření spermií metodou FISH pro nositele vrozených reciprokých a Robertsonových translokací, příp. pericentrických inverzí. Publikované frekvence chromozomálně nebalancovaných spermií se pohybují v rozmezí 0–37 % u nositelů pericentrických inverzí, 3–40 % u nositelů Robertsonových translokací a až 23–81 % u nositelů reciprokých translokací. Stanovení frekvence chromozomálně abnormálních spermií umožňuje individualizaci rizika u jednotlivých pacientů, informované rozhodování páru při plánování rodičovství a predikci úspěšnosti IVF cyklu.
The fluorescence in situ hybridization (FISH) method allows detection of frequencies of chromosomally abnormal spermatozoa in semen. Baseline levels of disomies for different chromosomes (0.03–0.47%) detected by FISH method in sperm from normal healthy donors have previously been published. Semen of healthy men usually contains approximately 7% of chromosomally abnormal spermatozoa, with aneuploidies of chromosomes 21, X and Y being the most frequent. However, a significant inter-individual variability was observed. Higher frequencies of numerical aberrations are often found in men with abnormal semen characteristics, in carriers of congenital chromosomal abnormalities (numerical sex chromosome aberrations, marker chromosomes, balanced translocations and inversions) and in sperm obtained by TESE. Sperm evaluation by the FISH method is of benefit especially for carriers of congenital reciprocal and Robertsonian translocations, or of some pericentric inversions. Published frequencies of chromosomally unbalanced sperm range from 0–37% in carriers of pericentric inversions, 3–40% in carriers of Robertsonian translocations and even 23–81% in carriers of reciprocal translocations. Assessment of frequencies of chromosomally abnormal spermatozoa allows personalized risk estimation in individual patients, making informed decisions concerning family planning and the prediction of IVF cycle outcome.
Salivární duktální karcinom (SDC) je vzácný, vysoce maligní nádor velkých slinných žláz, který charakterizuje agresivní klinické chování a histologická podobnost s duktálním invazivním karcinomem prsu. Bylo prokázáno, že amplifikace genu HER-2/neu a nadměrná exprese jeho genového produktu jsou nepříznivým prognostickým a prediktivním faktorem u invazivního karcinomu mléčné žlázy. Studie týkající se exprese HER-2/neu v karcinomech slinných žláz jsou nepočetné, s kontroverzními závěry. Cílem naší studie bylo zhodnotit vil případech SDC parotis overexpresi proteinu HER-2/neu imunohistochemícky (IHC) a porovnat s amplifikací genu HER-2/neu fluorescenční in situ hybridizací (FISH). Overexpresí proteinu HER-2/neu jsme pozorovali v 10 případech, amplifikací genu HER-2/neu jsme metodou FISH prokázali ve 4 z nich. Šest pacientů (55 %) zemřelo na generalizaci karcinomu za 4 až 44 měsíců po dokončení komplexní terapie a přežití se nelišilo významně u pacientů s karcinomem HER-2 imunohistochemícky pozitivním neamplifikovanym a HER.2 pozitivním amplifikovaným.
Salivary duct carcinoma (SDC) is highly malignant salivary gland tumour with aggressive clinical behaviour, characterised by its histological resemblance to invasive ductal carcinoma of the breast. Amplification of gene HER-2/neu and overexpression of its gene product have been shown to have both prognostic and treatment implications in breast cancer. The reports concerning the expression of c-erbB2/HER-2/neu in salivary gland tumours are few and controversial. Thus, eleven cases of SDC were evaluated for HER-2/neu status using immunohistochemistry (IHC) and fluorescent in situ hybridization (FISH). To the best of our knowledge, this is the first molecular genetic analysis of SDCs using FISH. HER-2/neu overexpression, identified as strong membrane staining, was observed in all but one case of SDC in majority of neoplastic cells while only four tumours, of nine cases analysed, revealed HER-2/neu gene amplification by means of FISH analysis. SDCs were associated with poor clinical outcome, 6 patients (55 %) died of disseminated carcinoma within 4 to 44 months after therapy. There was no difference in outcome of patients with IHC positive-nonamplifíed and IHC positive-amplified tumours.
Diagnostika bakteriálního původce sepse z hemokultur bývá stěžejním bodem pro následnou léčbu. Cílem studie bylo porovnat barvení podle Grama, kultivaci a biochemickou identifikaci s metodikou, která detekuje mikroorganismy z pozitivních hemokultur pomocí specificky připravených sond na podkladě genotypové metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a zjistit využitelnost této metody pro běžnou klinickou praxi. Metodou FISH bylo vyhodnoceno celkem 71 vzorků pozitivních hemokultur. Všechny tyto hemokultury byly zpracovány i klasickým způsobem tj. detekovány analyzátorem BACTEC, následně byly zachycené bakterie kultivovány na pevných půdách a biochemicky identifikovány. Shoda mezi výsledky získanými klasicky a stanovením HemoFISH nebyla stoprocentní, senzitivita byla 90,1 %. Velmi dobré výsledky vykazovala analýza stafylokoků a enterobakterií. Pouze ve třech případech jsme nezískali metodou FISH výsledek, protože nedošlo k hybridizaci sondy a bakteriální rRNA. Identifikace bakterií pomocí FISH je rychlejší než klasické metody, ale měla by být ověřena dalšími metodami.
The diagnosis of bacterial agents of sepsis from blood cultures is crucial for the subsequent treatment of this condition. The aim of this study was to compare Gram stain, culture, and biochemical identification (conventional methods) and fluorescence in-situ hybridisation (FISH) that detects microorganisms from positive blood cultures using specific probes. Another aim was to evaluate the potential of this method for use in clinical practice. Altogether 71 samples of positive blood cultures were tested by FISH. Blood cultures were also processed in the conventional way using the BACTEC analyser. The bacteria recovered were inoculated on solid media and then identified biochemically. The results obtained by the conventional methods and HemoFISH were not 100% concordant. The sensitivity of HemoFISH was 90.1%. Very good results were achieved for staphylococci and enterobacteria. FISH identification failed in three cases because the hybridization probes were not able to bind to bacterial rRNA. The FISH bacterial identification is faster than the conventional methods, but should be confirmed by the latter.
Východisko. Pouze asi 50 % žen s Turnerovým syndromem má podle literárních údajů karyotyp 45,X ve všech buňkách, ostatní mají mozaiky dvou nebo více buněčných klonů. S rozvojem nových metod se však ukazuje, že nemocných s mozaikami je pravděpodobně více, než se předpokládalo na základě klasických cytogenetických vyšetření. Cílem práce bylo sledovat početní odchylky chromozomu X v mitózách i v jádrech kultivovaných periferních lymfocytů žen s Turnerovým syndromem metodou FISH, určit rozdíly v citlivosti klasických a molekulárně cyto- genetických metod u těchto pacientek a porovnat je s kontrolní skupinou zdravých žen. Metody a výsledky. Vyšetřili jsme 18 žen s Turnerovým syndromem. Klasickou cytogenetickou analýzou jsme u 9 pacientek prokázali karyotyp 45,X ve všech hodnocených buňkách a u dalších 9 žen jsme nalezli mozaiku dvou nebo více buněčných klonů. Cytogenetické nálezy jsme porovnali s výsledky analýzy mitóz a interfázních buněk metodou FISH s a-satelitními sondami. Ve všech případech FISH potvrdila cytogenetické výsledky a kromě toho u 6 žen (30 %) prokázala existenci nových buněčných klonů, které nebyly zachyceny klasickou cytogenetikou. Závěry. Prokázali jsme vhodnost použití metody FISH při detekci mozaicismu u nemocných s Turnerovým syndromem. FISH díky vyšší senzitivitě umožňuje zachytit větší počet mozaikových linií než klasická cytogenetika.
Background. According to the literature approximately 50% of patients with Turner's syndrome have karyotype 45,X in every cell, the rest have two or more cell lines with mosaics of sex chromosomes. New methods have shown that the mosaicism is probably more frequent than expected from classical cytogenetics examinations. The aim of this study was to detect numerical changes of sex chromosomes in mitoses and interphase nuclei of cultivated peripheral lymphocytes of patients with Turner's syndrome by means of FISH, to compare the sensitivity of classical and molecular-cytogenetic methods and to estimate the values obtained in 10 control healthy females with karyotype 46,XX. Methods and Results. 18 females with Turner's syndrome were examined. Karyotype 45,X was found by classical cytogenetics in all cells of 9 females. The 9 remaining patients had sex chromosome mosaicism of two or more clones. In all patients FISH confirmed the results of classical cytogenetic methods and in 6 patients (30%) it revealed other clones previously not detected. Conclusions. Higher sensitivity of FISH enables more precise detection of mosaicism of cell lines than classical cytogenetics and this technique is more suitable for examinations of patients with Turner' syndrome.
Cíl studie: Seznámení čtenáře s problematikou preimplantační genetické diagnostiky a souboremlaboratorních postupů při odběru, úpravě a vyšetření pólových tělísek, spermií a embryí metodoufluorescenční in situ hybridizace (FISH) v programu fertilizace in vitro.Typ studie: Přehled.Název a sídlo pracoviště: Sanatorium REPROMEDA, Brno, Výzkumný ústav veterinárního lékařstvíBrno.Metodika: Stručný a výstižný přehled postupů při získání materiálu, přípravě vyšetřovaného vzorkua průběhu vyšetření chromosomů metodami FISH.Závěry: Práce přehledně zpracovává problematiku provedení PGD, zejména vyšetření chromosomálníchaneuploidií včetně metodiky odběru materiálu, přípravy k vlastní analýze FISH a provedenítéto analýzy.
Objective: Presentation of preimplantation genetic diagnosis and the set of laboratory processes likeaspiration, preparation and evaluation of polar bodies, sperm cells and blastomeres using FISHmethod (fluorescent in situ hybridization) in ART.Design: Review.Setting: Sanatorium REPROMEDA, Brno, Veterinary Research Institute, Brno.Methods: Overview of published data and own clinical experience with the cell aspiration methods,evaluated sample preparation and the proper chromosomes visualisation using FISH method.Conclusion: The review brings an overview of conditions and methods including sample obtaining,FISH analysis preparation and implementation, processed during PGD.
- MeSH
- blastomery MeSH
- dospělí MeSH
- fertilizace in vitro MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční MeSH
- lidé MeSH
- odběr biologického vzorku MeSH
- oocyty MeSH
- preimplantační diagnóza metody MeSH
- spermie MeSH
- Check Tag
- dospělí MeSH
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
Duchenneova a Beckerova svalová dystrofie (DMD/BMD) jsou na X chromosom vázaná recesivně dědičná onemocnění způsobená mutacemi v genu, který kóduje protein dystrofiu. U približně 65 % pacientů postižených DMD a BMD se zjistí velká intragenová delece v dystrofínovém genu. Matky postižených chlapců jsou asi ve dvou třetinách případů přenašečkami prislušné mutace v dystrofínovém genu. U postižených probandů se detekce delecí v dystrofínovém genu rutinně provádí metodami vícenásobné polymerázové řetězové reakce (mPCR), RT-PCR (reverzně transkriptázové PCR) s testem na zkrácený protein (PTT - protein truncation test) či Southern blottingem. Detekce delecí u přenašeček je komplikována přítomností kopie genu pro dystrofiu na druhém chromosomu X. V naší studii prezentujeme diagnostickou strategii, která využívá metodu fluorescenční in situ hybridizace (FISH) pro detekci přenašeček DMD/BMD. Použili jsme set šesti kosmidových prob na detekci nejčastěji deletovaných oblastí dystrofínového genu získaných z oddělení lékařské genetiky Leidenské Univerzity (Department of Human Genetics, Leiden University Medical Center). Vyšetřili jsme 14 matek probandů, u nichž byla metodou mPCR nebo RT-PCR/PTT zjištěna a definována delece v dystrofinovém genu. Ve 4 případech byla matka postiženého probanda identifikována jako přenašečka delece v dystrofínovém genu. U čtyř zdravých žen kontrolní skupiny jsme neprokázali delece ve vyšetřovaných exonech. Žádný ze získaných výsledků nebyl v rozporu s výsledky mPCR či RT-PCR/PTT. Na základě našich výsledků jsme tíospěli k závěru, že fluorescenční in situ hybridizace je efektivní a přímou metodou pro identifíkaci přenašeček delecí v dystrofínovém genu a navrhujeme ji jako metodu první volby v diagnostice přenašeček DMD/BMD.
Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD/BMD) are X-linked recessive disorders caused by mutations in the dystrophin gene. A large intragenic deletion has been described in about 65% of DMD/BMD patients. Mothers of affected males are DMD/BMD carriers in two thirds of the cases. Routine deletions detection in DMD/BMD males is performed using multiplex polymerase chain reaction (mPCR), RT-PCR with a protein truncation test (PTT) or using Southern blotting. In females the deletions detection is complicated by the presence of a normal gene copy on the second X-chromosome. We are presenting the diagnostic strategy using FISH for the deletions detection in the dystrophin gene of female DMD/BMD carriers. We have used a set of six cosmid probes for the detection of the most ft-equently deleted areas of the dystrophin gene from the Department of Human Genetics, Leiden University Medical Center. We have examined 14 mothers of DMD/BMD males with a deletion in the dystrophin gene identifíed using mPCR. Four mothers of affected males have been diagnosed as carriers of a deletion in the dystrophin gene. We have revealed no deletion mutations in the exons examined in a control group of four healthy females. No discrepancy has been found between the FISH analysis residts and the results of mPCR. Our results indicate that FISH is an effective and direct method for the identification of DMD/BMD carriers and we suggest this method as a method of a first choice in the identification of DMD/BMD carriers.
