Cíl: Cílem retrospektivní studie bylo sumarizovat a zhodnotit výsledky pacientů s podezřením na infekci rodem Chlamydia vyšetřených pomocí „in house“ metody nested PCR (polymerázová řetězová reakce). Studie pracuje s daty získanými vyšetřením pacientů v letech 2001-2003 z regionu východních Čech na Oddělení molekulární biologie společného pracoviště Ústavu klinické mikrobiologie (ÚKM) a Ústavu klinické biochemie a diagnostiky (ÚKBD). Materiál a metodika: V roce 2001 bylo provedeno 291 vyšetření, v roce 2002 to bylo již 562 a v roce 2003 dokonce 760 vyšetření. Celkem bylo za toto období přijato 1 613 vzorků k vyšetření, z nichž jich bylo 1 587 vyšetřeno (26 nepoužitelných vzorků). Více jak 70 % všech vyšetření se provádělo ze tří druhů materiálu: moči (41,8 % všech vyšetřených vzorků), BALu (bronchoalveolární laváž; 15,3 % všech vyšetřených vzorků) a plné krve (14,9 % všech vyšetřených vzorků). Vyšetření bylo provedeno pomocí „in house“ metody nested PCR využívající primery z oblasti MOMP (ompA) genu Chlamydia spp. Výsledky: Celková pozitivita činila 5,67 %, 1,26 % vzorků bylo vyhodnoceno jako nejasný výsledek a 93,07 % vyšetřovaných vzorků bylo negativních. U mužů byla zachycena PCR pozitivita u 6,11 % a u žen toto číslo činilo 5,35 %. Nejvíce pozitivních vzorků pocházelo z věkových skupin 70-791etých (11,67 %), 10-191etých (6,51 %) a 40-491etých (6,45 %). Celková pozitivita u stěrů z urogenitálního systému byla 6,48 %, z moči 3,92 %, BALu 10,70 % a plné krve 5,51 %.

Purpose of the study. The study was intended to summarize and evaluate the results in patients with a suspected infection by the genus Chiamydia, investigated with an „in-house" method of nested PCR (polymerase chain reaction). The study worked with data from patients living in eastern Bohemia, who were examined in the years 2001-2003 at the Dept. of Molecular Biology a research laboratory shared by the Institute of Clinical Microbiology and the Institute of Clinical Biochemistry and Diagnostics. Material and methods: 291 explorations were done in 2001, in 2002 already 562 and in 2003 their figure reached 760. The total number of samples received for investigation during that period was I 613. 1 587 were actually investigated, 26 were unsuitable and could not be used. More than 70 % of all investigations were done with three types of material: urine (41.8 % of all the investigated samples), BAL (15.3 % of all the investigated samples) and whole blood (14.9 % of all the investigated samples). The investigations were carried out with the „in-house" nested PCR method, which uses primers from the MOMP(ompA) area of the genus Chlamydia spp. Results: Total positivity was 5.67 %, in 1.26 % of the samples the resulted was considered uncertain and 93.07 % of the investigated sampies were negative. In men PCR positivity was 6.11 %, in women 5.35 %. The major proportion of positive samples was from the age groups 70-79 years (11.67 %), 10-19 years (6.51 %) and 40-49 years (6.45 %). Overall positivity in smears from the urogenital system was 6.48 %, from urine 3.92 %, from BAL 10.70 % and from whole blood 5.51 %.

• MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   MeSH
• hodnocení výsledků zdravotní péče MeSH
• infekce bakteriemi čeledi Chlamydiaceae diagnóza   patologie   MeSH
• lidé MeSH
• molekulární biologie metody   MeSH
• pohlavní dimorfismus MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• populační charakteristiky MeSH
• retrospektivní studie MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Přestože PCR detekce mykotických patogenů v klinických vzorcích se na stránkách odborných časopisů objevuje již více než dvacet let, je použití této metody pro rutinní diagnostiku invazivní aspergilózy stále diskutabilní. A to i přesto, že metody molekulární biologie již našly své stálé místo v mnoha odvětvích moderní mikrobiologie. Genotypizace bakteriálních kmenů rezistentních na antibiotika, molekulární epidemiologie, ale i rutinní detekce, např. virových infekcí z nejrůznějších klinických materiálů je v dnešní době zcela běžnou praxí. Ve všech těchto oblastech znamenalo zavedení metody PCR diagnostiky zrychlení, zfpřesnění a zjednodušení celého procesu. Tento přehledový článek má za cíl ukázat, v čem je detekce původců mykotických infekcí jiná a proč se ji dosud nepodařilo zavést do rutinní praxe.

PCR detection of fungal pathogens in clinical samples has been discussed in journals for more than two decades. However, its use for diagnosing invasive aspergillosis is still controversial, despite the fact that molecular methods are routinely used in various fields of modern microbiology. These are e. g. genotyping of bacterial strains resistant to antibiotics, molecular epidemiology or routine detection of viral infections in clinical material. PCR methods have made the diagnostic apphcations faster, simpler and more accurate. This review deals with issues related to molecular methods for diagnosing invasive fungal infections and the main factors limiting their use in everyday clinical practice.

• MeSH
• aspergilóza diagnóza   genetika   MeSH
• financování organizované MeSH
• plicní mykózy diagnóza   genetika   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH

Práce podává přehled klinického materiálu používaného pro diagnostiku syfilis metodou polymerázové řetězové reakce. PCR je rutinní metodou detekce T. pallidum ve stěrech z ulcerací a v kožně-slizničních projevech primární a sekundární syfilis. Vyšetřit lze i nesrážlivou krev, mozkomíšní mok, amniovou tekutinu, punktáty, bioptický materiál i fixované tkáně. Pro vyšetřování těchto materiálů v klinické praxi je však nutno získat více zkušeností především s citlivostí PCR v různých stadiích syfilis.

A review is presented of types of clinical specimens used for diagnosis of syphilis by polymerase chain reaction. PCR is a routine method for detection of T. pallidum in swabs of chancres and primary and secondary syphilis mucocutaneous lesions. Whole blood, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, aspirate and biopsy specimens, and paraffin-embedded tissues can also be tested by PCR for T. pallidum. However, further research on PCR detection sensitivity at various stages of syphilis is needed before these specimens are used in clinical practice.

• MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• fluorescenční protilátková technika přímá využití   MeSH
• lidé MeSH
• odběr biologického vzorku metody   využití   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   trendy   využití   MeSH
• sérologická diagnostika syfilis metody   trendy   využití   MeSH
• Treponema pallidum imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

Vo svete sa pri stanovení progresie viacerých typov karcinómov, ako napríklad karcinomu prsníka, pľúc, prostaty či močového mechúra, sleduje prítomnosť cirkulujúcich buniek (mikrometastáz) v krvnom riečišti. Tieto metodiky sa postupne zavádzajú i na Slovensku. Ako prví sme sa v rámci Ústavu lekárskej biológie a genetiky LF UKo v spolupráci s Urologickou klinikou LF UKo vo FNsP akademika Dérera pokúsili o využitie tejto metódy pri karcinome prostaty (CaP). Detekovali sme prítomnosť epitelových buniek prostaty v periférnej krvi pacientov s pokročilým štádiom karcinomu prostaty, u ktorých dovtedy neboli zistené metastázy.

During assessment of the progression of several types of carcinomas, such as cancer of the breast, lungs, prostate or urinary bladder world-wide the presence of circulating cells (micrometastases) in the circulation is followed up. These methods are gradually introduced also in Slovakia. First we tried in the Institute of Medical Biology and Genetics Medical Faculty Comenius University in collaboration with the Urological Clinic of Dérers the Faculty Hospital with policlinic to apply this method in carcinoma of the prostate (CaP). We detected the presence of epithelial prostate cells in the peripheral blood stream of patients with advanced prostate cancer where before secondaries were not detected.

• MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• kalikreiny genetika   krev   MeSH
• karcinom diagnóza   MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• membránové glykoproteiny genetika   krev   MeSH
• nádory prostaty komplikace   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   přístrojové vybavení   MeSH
• prostatický specifický antigen fyziologie   krev   sekrece   MeSH
• senioři MeSH
• Check Tag
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři MeSH
• Publikační typ
• kazuistiky MeSH
• přehledy MeSH

Polymerázová řetězová reakce, známá pod anglickou zkratkou PCR, se od svého objevu v 80. letech minulého století stala jednou ze základních metod detekce a kvantifikace nukleových kyselin. Díky vysoké rychlosti, citlivosti a specificitě se používá v mnoha aplikacích v oblasti molekulární biologie, přírodních věd, zemědělství i medicíny. Do reakční směsi se ale mohou ze vzorku nebo v průběhu jeho zpracování dostat látky, které mohou PCR reakci inhibovat nebo stimulovat. Výsledkem je pak nadhodnocení, resp. podhodnocení obsahu DNA ve vzorku. Inhibici PCR reakce lze rozpoznat pomocí určení efektivity reakce, spočívající v analýze sériových ředění vzorku. Rychlejší a elegantnější způsob spočívá v použití interní kontroly, což je nejčastěji exogenní DNA, která je koamplifikována spolu se vzorkem.

Since its discovery in the 1980', the polymerase chain reaction (PCR) has become one of the main methods for detection and quantification of nucleic acids. Because of its speed, sensitivity and specificity, PCR is used in many applications in molecular biology, life sciences, agriculture and medicine. However, many substances may get into in the reaction mixture from the sample or during the sample processing that can inhibit or enhance the PCR reaction. As a result, the DNA content in the sample is under- or overestimated, respectively. It is possible to indentify the inhibition by evaluating the eÇciency of the PCR reaction by analysing serial dilutions of the sample. More elegant and faster method consists in using an internal control which is a usually exogenous DNA coamplified with the target DNA.

• MeSH
• inhibitory syntézy nukleových kyselin * MeSH
• polymerázová řetězová reakce * metody   normy   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Cieľ štúdie: Autori testovali variant polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) – „nested“ (N-PCR)na detekciu ľudského papilomavírusu (HPV) vo vzorkách cervikálnych sterov u gynekologickýchpacientok. Táto metodika je založená na opakovanej amplifi kácii špecifi ckých úsekov DNA vírusu.Porovnávali citlivosť N-PCR s používanou hybridizačnou metodikou. Pozitívne vzorky v druhejčasti pokusov použili na typizáciu detekovaných HPV-DNA pomocou PCR.Súbor: Účinnosť N-PCR pri detekcii HPV overili na 30 vzorkách z cytologicky/histologicky suspektnýchcervikálnych lézií, kde bola predchádzajúca detekcia HPV hybridizačnou metódou neúspešná.Druhý súbor tvorilo 21 vzoriek odobratých po konizácii, u ktorých sa hybridizačnou metódou prítomnosťHPV pred zákrokom potvrdila, ale po operácii hybridizácia HPV-DNA bola negatívna.Výsledky: „Nested“ PCR detekovala prítomnosť HPV-DNA vo všetkých 30 vzorkách (100 %) z prvéhosúboru a v 8 vzorkách (38 %) získaných po konizácii.V 20 prípadoch z prvej série bol typovo-špecifi ckou PCR dokázaný vírus HPV 16, v 6 prípadochHPV 18, vo zvyšných 4 prípadoch typizácia zameraná na HPV 16, 18, 31, 33 nebola úspešná. Vovšetkých 8 vzorkách, kde sa pomocou N-PCR preukázala prítomnosť HPV-DNA po konizácii, satypovo-špecifi ckou PCR detekoval HR-HPV 16.Záver: „Nested“-PCR je v súčasnosti pravdepodobne najcitlivejšou metodikou na detekciu HPV.Nevýhodou je pomerne zložitý metodický postup a nároky na prístrojové a personálne vybavenielaboratórií, schopných rutinne využívať túto metodiku.

Objective: The authors tested PCR – so called nested (N-PCR) for the detection of HPV in cervicallesions of uterus. This method is based on repeated amplifi cation of specifi c viral DNA fragments.The sensitivity of N-PCR was compared to the sensitivity of the hybridization method. In the secondpart of the experiment positive samples underwent HPV typing by PCR.Background: The effectiveness of N-PCR for HPV detection was verifi ed on 30 samples fromcytologically/histologically suspected cervical lesions. In these cases, previous detection byhybridization method was unsuccessful. The second group consisted of 21 samples acquired byconisation, in which HPV presence was confi rmed by hybridization method. Post surgery HPVdetection using hybridization technique was negative in this group of patients.Results: By means of N-PCR the presence of HPV DNA was confi rmed in all 30 samples fromthe fi rst group (100%) and in 8 (38%) cases from the group of samples obtained after conisation.Type-specifi c PCR detection indicated HPV type 16 in 20 cases, HPV type 18 in 6 cases (from thefi rst series). In the remaining 4 cases typing for HPV 16, 18, 31 and 33 was negative. In the secondseries all 8 samples were HR-HPV type 16.Conclusion: At the present time, N-PCR is probably the most sensitive HPV detection method. Theonly real disadvantages of the given technique are relatively high costs of diagnostics equipmentand the requirement of highly qualifi ed personel.

• MeSH
• DNA primery aplikace a dávkování   diagnostické užití   chemie   MeSH
• lidé MeSH
• nádory děložního čípku diagnóza   etiologie   MeSH
• Papillomaviridae genetika   patogenita   MeSH
• plošný screening MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   přístrojové vybavení   MeSH
• prognóza MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

Cílem studie bylo zavedení detekce bodové mutace na 12. kodonu prvního exonu Ki-ras genu u nemocných s adenokarcinomem pankreatu použitím tří modifikací polymerázové řetězové reakce a následným restrikčním štěpením (PCR-RFLP) naamplifikovaných produktů. K detekci byly využity tři dvojice primerů generujících artefaciální místo pro restrikční enzymy s pouze jednou alelickou formou. Použitím dvoustupňové PCR-RFLP a dvou modifikací jednostupňové PCRRFLP bylo vyšetřeno 12 DNA vyizolovaných ze solidních tumorů (5), pankreatických sekretů (6) a z lymfocytů periferní krve (1) u pacienta s generalizováným stadiem onemocnění. Studie podává srovnání použitých metod k detekci mutace na Ki-ras genu a kloní se k závěru, že dvoustupňová PCR-RFLP analýza vzhledem ke své citlivosti je vhodnou metodou pro detekci bodových mutací bez použití oligonukleotidových hybridizací a sekvenace DNA.

Present study was undertaken to detect Ki-ras point mutation at codon 12 in pancreatic adenocarcinomas (CaP) using the polymerase chain reaction-restriction fi"agment lengths polymorphism (PCR-RFLP). Three modifications of PCR-RFLP were performed with a mismatched primers creating a recognition site with only one allelic form (wild or mutated). Using two-step PCR-RFLP and two modifications of one-step PCR-RFLP we examined 5 resected adenocarcinomas of pancreas, 6 pancreatic juices and one DNA sample from peripheral blood of patient with generalized stadium of CaP. We compare all techniques and conclude, that the very sensitive two step PCR-RFLP is a suitable method for detection point mutations and eliminates the need for either oligonucleotide hybridization or DNA sequencing.

• MeSH
• adenokarcinom diagnóza   MeSH
• bodová mutace MeSH
• DNA analýza   MeSH
• geny ras MeSH
• lidé MeSH
• nádory slinivky břišní diagnóza   MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

Cíl: Zavedení, charakterizace a porovnaní dvou metod kvantitativního stanovení viru hepatitidy B-HBV DNA. Obě metody používají totožného principu měření na bázi reál time PCR. První z nich je prováděna pomocí analytického systému LightCycler Roche Diagnostics a druhá na přístroji Rotorgene Corbett Research. Předmětem porovnávání metod byla linearita a pracovní rozsah stanovení, mez detekce, klinická senzitivita a specifičnost obou metod a jejich diagnostická správnost. Materiál: Oběma metodami bylo simultánně analyzováno 68 sér pacientů s diagnostikovanou chronickou hepatitidou B v různých fázích choroby. Výsledky: Regresní analýzou jsme stanovili hodnotu korelačního koeficientu r= 0,995 (p < 0,0001), potvrzující velmi úzký vztah mezi souborem výsledků získaných oběma metodami. Přesnost měření obou metod nepřekračuje hodnotu CV = 15 %. Obě metody disponují vysokým rozsahem linearity měření v intervalu lO 3-lO 8 kopií HBV DNA/ml. Diagnostická správnost srovnávaných metod byla vyhodnocena ROC analýzou. Pro obě metody byla zjištěna hodnota klinické sensitivity 100 %, klinická specifičnost metody LightCycler činila 96 % ve srovnání s 95 % u metody Rotorgene. Klinická efektivita, vyjádřená hodnotou AUC (plochy pod krivkou) byla 0,995 (LightCycler) respektive 0,994 (Rotorgene). Metoda LightCycler vykázala vyšší hodnotu pozitivního pravděpodobnostního poměru + LR = 26 oproti hodnotě 19,5 u Rotorgenu. Závěr: Uvedené údaje vypovídají o velmi vysoké hodnotě klinické užitečnosti obou metod.

Objective: Introduce, characterize and compare two methods of hepatitis virus B DNA quantification in serum. Both methods are based on real time PCR principle. Two measurement systems, LightCycler Roche and Rotorgene Corbett Research were used. We evaluated and compared their precision, linearity, limit of detection, clinical sensitivity, clinical specificity and diagnostic accuracy. Materials: By use of mentioned methods we analysed 68 sera from patients with diagnosed chronic hepatitis B in different stages of disease. Results: Correlation coefficient 0,995 (p < 0,0001) obtained by linear regression analysis shows excellent relationship between results of evaluated methods. The coefficients of variation for repeatability and reproducibility indicate very good measurement precision and are in all cases lower than 15 %. Linearity of both methods has very broad range lO 3 -lO 8copies of HBV DNA/ml. It means that majority of samples may be analysed without repeating after sample dilution. By use of ROC analysis we determined AUC value 0,995, clinical sensitivity 100 %, specificity 96 % and positive likelihood ratio (+LR) 26,0 for LightCycler, resp. AUC = 0,994, specificity 95 %, +LR = 19,5 for Rotorgene. Conclusion: All analytical and clinical characteristics of introduced methods show their usefulness for diagnosis and treatment of chronic hepatitis B.

• MeSH
• DNA viry imunologie   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   přístrojové vybavení   využití   MeSH
• techniky in vitro MeSH
• virus hepatitidy B imunologie   MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

Cíl studie: Rychlá detekce nejčastějších aneuploidií pomocí metody multiplex QF PCR na nekultivovaných vzorcích choriové tkáně. Shrnutí výsledků aplikace multiplex QF PCR v managmentu péče o těhotné ženy v prvním trimestru gravidity. Typ studie: Původní práce. Název a sídlo pracoviště: Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny FN a LF UP, Olomouc. Metodika: Vzorky choriové tkáně byly získány od 101 gravidních žen. Nekultivované vzorky byly zpracovány metodou multiplex QF PCR. Analyzovány byly STR lokusy chromozomů 13, 18, 21 a X, Y. Tyto markery byly amplifikovány ve 2 oddělených multiplex PCR reakcích za stejných podmínek a podrobeny fragmentační analýze v kapilární elektroforéze. Výsledky: Všech 101 analyzovaných vzorků choriové tkáně bylo úspěšně amplifikováno. V tomto souboru bylo metodou multiplex QF PCR celkem detekováno 16 patologií u plodů. Ve dvou případech se jednalo o triploidii, v sedmi případech byla zachycena trizomie chromozomu 21 – Downův syndrom, v šesti případech pak trizomie chromozomu 18 – Edwardsův syndrom a jednou byla odhalena monozomie gonozomu X – Turnerův syndrom. Závěr: Metoda multiplex QF PCR je nedílnou součástí screeningu prvního trimestru a poskytuje rychle dostupný a spolehlivý výsledek u vyšetřovaných pacientek.

Objective: Rapid detection of most frequent aneuploidies by the multiplex QF PCR method in non-cultured samples of chorial tissue. Summarized results of QF PCR method applied in the management of care of pregnant women in the first trimester of pregnancy. Type of study: An original contribution. Setting: Institute of Medical Genetics and Fetal Medicine, Faculty Hospital and Medical Faculty, Palacky University Olomouc. Methods: The samples of chorial tissue were obtained from 101 pregnant women. Non-cultured samples were processed by the multiplex QF PCR method. STR loci of chromosomes 13, 18, 21 and X and Y were analyzed. These markers were amplified in two separate multiplex PCR reactions under the same conditions and subjected to fragmentation analysis in capillary electrophoresis. Results: All 101 analyzed samples of chorial tissue were successfully amplified. In this group, 16 pathologies of the fetuses were detected by the multiplex QF PCR method. Triploidy was detected in two cases, trisomy of chromosome 21 – Down syndrome was found in seven cases, and trisomy of chromosome 18 – Edwards syndrome was found in six cases and monosomy of gonosome X – the Turner’ s syndrome was revealed once. Conclusions: The multiplex QF PCR method is an indispensable part of the screening of the first trimester and provides a rapidly available and reliable result in the examined patients.

• MeSH
• aneuploidie MeSH
• cytogenetické vyšetření metody   trendy   využití   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• genetické testování etika   metody   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   využití   MeSH
• prenatální diagnóza metody   trendy   využití   MeSH
• první trimestr těhotenství genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• srovnávací studie MeSH

Bylo provedeno srovnání devíti metod izolace specifické DNA etiologického agens humánní granulocytárníehrlichiózy z lidské krve pro účely vyšetření PCR. Do plné krve zdravého dárce byladefinovaně přimíšena laboratorní kultura agens a testována účinnost izolace a stabilita templátuza podmínek, kdy byla krev čerstvá nebo zmražená. K univerzálnímu použití byl nejvhodnějšíQIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN), zmražená krev byla nejlépe extrahována pomocí Nucleo SpinTissue (Macherey-Nagel).

The author compared nine methods for isolation of specific DNA of the etiological agent of humangranulocytic ehrlichiosis from human blood for examination of the PCR. To full blood of healthydonors a laboratory culture of the agent was added and the effectiveness of isolation an stability ofthe template was tested under conditions when the blood was fresh or frozen. For universal useQIAamp® (QIAGEN) was most suitable, frozen blood was extracted best using NucleoSpin® Tissue(Macherey-Nagel).

• MeSH
• Anaplasma patogenita   MeSH
• DNA MeSH
• ehrlichióza diagnóza   etiologie   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• klinické laboratorní techniky metody   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• seriová extrakce metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH