Východisko. Kvantifikace fluorescenčně značených PCR produktů na kapilární elektroforéze (QF PCR) má své limity především v citlivějších analýzách, ve kterých je potřebné zachytit minoritní buněčnou linii a rozpoznat malé změny v závislosti na čase. V těchto případech může být chyba měření a reprodukovatelnost výsledků velmi ovlivněna hlavně lidským faktorem a efektivitou PCR. Hlavním cílem studie bylo posoudit a optimalizovat kvantitativní možnosti inovované QF PCR s přímou návazností na kvantifikaci Y sekvencí u gonozomálních mozaik. Metody a výsledky. Arteficiálně vytvořené Y/X DNA mozaiky byly testovány a kvantifikovány inovovanou QF PCR, která nahrazuje a rozšiřuje real-time PCR. Na základě porovnání intenzity fluorescence PCR produktů po jednotlivých cyklech byly sestrojeny grafy nárůstu fluorescence pro různá ředění. Analýzou podílu signálu vnitřní kontroly a příslušné mozaiky byla sestrojena kalibrační křivka pro kvantifikaci Y sekvencí. Pro výpočet vzácných mozaik byl sestaven empirický vzorec. Závěry. Rozšíření QF PCR o manuální real-time PCR eliminuje meze QF PCR a zpřesňuje kvantifikační analýzy založené na PCR. Novelizovaný DNA diagnostický přístup – IQF PCR, který se vyznačuje vysokou citlivostí a přesností, umožňuje významný posun v analýze gonozomálních Y/X mozaik.

Background. Quantification of fluorescence labelled PCR products on capillary electrophoresis (QF PCR) has limits primarily in the possibility of more sensitive analyses to detect minority cell lines and small time related variations. PCR efficiency and human factor affect measuring error and reproducibility of results in these cases. The aim of this work was to assess and optimise of innovated (I)QF PCR in quantification of Y sequences in gonosomal mosaics. Methods and Results. Artificially prepared Y/X mosaics were tested and quantified by IQF PCR, which replaces real-time PCR. Comparison of relative fluorescence to PCR cycles in different Y/X dilutions was plotted on the graphs. Calibration curve for Y sequences quantification was set by the analyses of ratio of Y/X fluorescent signals. An empirical formula was created for the rare mosaic calculation. Conclusions. QF PCR refined by manual real-time PCR eliminates limits of QF PCR and specifies quantitative analyses based on PCR. The outstanding feature of IQF PCR is its high sensitivity and accuracy in quantification of Y/X gonosomal mosaics.

• MeSH
• chromozomální delece MeSH
• cytogenetické vyšetření metody   MeSH
• DNA analýza   MeSH
• elektroforéza kapilární metody   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• fluorescence MeSH
• lidé MeSH
• mozaicismus MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• analýza potravin MeSH
• anthokyaniny analýza   genetika   MeSH
• bez černý škodlivé účinky   MeSH
• financování organizované MeSH
• kontrola potravin MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• potravinářská barviva analýza   MeSH
• víno analýza   MeSH

Chronická myeloidní leukémie (CML) je charakterizována přítomností hybridního genu BCR-ABL, který vzniká v důsledku reciproké translokace t(9;22)(q34;q11) karyotypicky detekovatelné jako Ph chromozóm. Gen BCR-ABL kóduje hybridní protein s konstitutivně zvýšenou tyrozinkinázovou aktivitou, o kterém bylo prokázáno, že hraje zásadní roli v patogenezi onemocnění. Gen BCR-ABL je typickým znakem CML sloužícím k upřesnění diagnózy a sledování úspěšnosti léčby. Nejcitlivější metodou pro zjištění přítomnosti této aberace je reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) detekující transkript BCR-ABL, se schopností zjistit 1 leukemickou buňku mezi 105–106 normálních leukocytů. Pro sledování změn v hladině transkriptů BCR-ABL je využívána kvantitativní RT-PCR (Q-RT-PCR), která má vysoký prognostický význam. Nárůst a vysoká hladina transkriptu BCR-ABL jednoznačně signalizují špatnou odpověď na léčbu a špatnou prognózu, naproti tomu pokles a nízká hladina BCR-ABL dobrou odpověď na léčbu a dobrou prognózu. Pomocí Q-RT-PCR je možno zjistit změny stavu onemocnění o několik týdnů i měsíců dříve než ostatními metodami. V ÚHKT v Praze byla Q-RT-PCR zavedena v roce 1994 pro potřebu časného zjištění relapsu u pacientů po transplantaci kmenových buněk (TKB) a nyní je využívána pro monitorování úspěšnosti léčby všech pacientů s CML. Potvrdili jsme, že tato citlivá, přesná a neinvazivní vyšetřovací metoda má pro sledování stavu pacientů s CML zásadní význam.

Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by the presence of BCR-ABL fusion gene resulting from the reciprocal chromosome translocation t(9;22)(q34;q11), karyotypically detected as Ph chromosome. BCR-ABL gene was proved to play the principal role in CML pathogenesis. It is a hallmark of CML used in diagnostics and monitoring of the response to the therapy. The most sensitive method of detecting BCR-ABL aberration is RT-PCR which is able to find a single in leukemic cell betweey 106 normal leukocytes. Monitoring of BCR-ABL transcript level by quantitative RT-PCR is of the high prognostic value. High or increasing BCR-ABL transcript number signalizes bad response to treatment and a bad prognosis. On the contrary RT-PCR negativity, low level, or decreasing BCR-ABL transcript number denotes good response to treatment and good prognosis. Q-RT-PCR can detect changes in disease status several weeks or even months earlier than other methods. In 1994 the Q-RT-PCR was introduced at the Institute of Hematology and Blood Transfusion in Prague and was used for early detection of relapse after transplantation. At present it is used in all patients with CML for monitoring of response to the treatment. We have confirmed that this precise, sensitive and non-invasive method is of the principal importance for monitoring of disease status in CML patients.

• MeSH
• bcr-abl fúzové proteiny farmakokinetika   genetika   krev   MeSH
• chronická myeloidní leukemie diagnóza   genetika   terapie   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• lidé MeSH
• methansulfonáty aplikace a dávkování   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí ekonomika   metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• přehledová literatura jako téma MeSH
• prognóza MeSH
• transplantace kmenových buněk MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

Real-time PCR je citlivá metoda pro analýzu RNA založená na základě měření fl uorescence. Je využívána v základním výzkumu, molekulární medicíně a v biotechnologiích. Kvantitativní PCR je jednoduchá, s vysokou citlivostí a spolehlivostí. Tato technika se rychle rozvíjí s objevem nových enzymů, chemikálií a přístrojů a slouží mimo jiné k potvrzení dat získaných pomocí sledování genové exprese mikročipovou analýzou. Tato práce seznamuje s principem real-time PCR a popisuje její využití ve studiu mnohočetného myelomu a celkově v hematologii.

Real-time PCR is a sensitive method for RNA analysis based on fl uorescence measurement. It is used in basic research, applied molecular medicine, and biotechnology. Real-time PCR assays are easy to perform and combine high sensitivity with reliability. The technology is evolving rapidly with the introduction of new reagents and instrumentation. It can be used for the confi rmation of data acquired by microarray analysis of gene expression. We review basic principles of real-time PCR and describe its application in hematology and especially in multiple myeloma research.

• MeSH
• exprese genu MeSH
• fluorescenční barviva MeSH
• hematologie * MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce * metody   MeSH
• lidé MeSH
• messenger RNA MeSH
• mnohočetný myelom * diagnóza   genetika   MeSH
• transkriptom genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

Folikulámí lymfomy (FL) jsou diagnostikovány na základě histologického obrazu a imunohistochemického profilu (CD20+, CD79álfa+, CD10+, BCL-2+, CD5-). U většiny nemocných s FL je prítomna translokace t(14;18)(q32;q21). Gen BCL2 (18q21) se dostává pod kontrolu regulačních oblastí genu IGH (14q32) a tím dochází ke zvýšené expresi proteinu BCL-2. Průkaz translokace lze využít pro následné monitorování nemocných (infiltrace kostní dřeně a perífemí krve nádorovými bunkami). Cílem studie bylo zavést na pracoviště metodu kvantitativní PCR (RQ-PCR, „realtime quantification") pro stanovení množství buněk nesoucích translokaci t(14;18) u nemocných s FL. Pro vyhledání translokace jsme použili metodu fluorescenční in situ hybrídizace na interfázických jádrech (I-FISH) v histologických řezech. Pomocí kvalitativní PCR jsme vybrali FL se zlomem genu BCL2 v hlavní zlomové oblasti (mbr). U nemocných s tímto znakem jsme pomocí RQ-PCR stanovovali relativní množství nádorových buněk nesoucích t(14;18). Množství buněk s touto translokaci v lymfatických uzlinách bylo podstatně vyšší než v kostní dřeni či v perífemí krvi. Metoda RQ-PCR, na rozdíl od kvalitativní PCR, umožňuje nejen konstatovat přítomnost nádorových buněk v periferní krvi a v kostní dřeni, ale jejím zásadním prínosem je určení množství nádorových buněk nesoucích t(14;18). Metoda RQ-PCR umožní sledovat aktivitu onemocnění (přechod do remise nebo vznik relapsu) a zjistit nástup dřeňového relapsu ještě před morfologicky prokazatelnou infiltrací kostní dřeně nebo perífemí krve.

Diagnosis of follicular lymphoma (FL) is based on histology and immunohistochemical profile (CD20+, CD79alfa+, CD10+, BCL-2+, CD5-). A chromosomal marker - translocation t(14;18)(q32;q21) supporting the tumor diagnosis and useful for monitoring bone marrow or peripheral blood infiltration by the tumor cells is also used. The BCL2 gene (18q21) is controlled by an enhancer of the IGH gene (14q32) resulting in BCL-2 protein overexpression. The translocation is present in the majority of patients with FL. The aim of the study was to introduce the quantitative PCR (RQ-PCR, real-time quantification) method for the assessment of the quantity of cells bearing the translocation t(14;18) in patients with FL. The fluorescence in situ hybrídization on interphasic nuclei (I-FISH) in histologic sections was used for screening of patients with the t(14;18). A search for the break of the BCL2 gene at the major breakpoint region (mbr) was performed by means of qualitative PCR. We determined the relative number of the tumor cells bearíng t(14;18) translocation (mbr) in patients with FL by the RQ-PCR. The relative quantity of these cells was significantly higher in the lymph nodes than in the bone marrow or peripheral blood. The RQ-PCR is a tool of choice to monitor the activity of the disease in individual patients, and to detect an early disease relapse before its manifestation at the level diagnosed by morphology.

• MeSH
• folikulární lymfom diagnóza   genetika   MeSH
• hybridizace in situ fluorescenční MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• reziduální nádor diagnóza   MeSH
• translokace genetická MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

Polymerasová řetězová reakce (PCR) je metoda používaná pro namnožení specifického úseku DNA. Pro své vlastnosti se stala tato technika oblíbenou a v praxi hojně používanou metodou. V současné době rozlišujeme tři generace PCR – tradiční PCR (I. generace), kvantitativní PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase – qPCR (II. generace) a digitální PCR – dPCR (III. generace). dPCR je robustní a citlivá metoda, díky čemuž nachází uplatnění v mnoha oblastech jako je mikrobiologie, analýza potravin, onkologie apod. Využívá se především pro absolutní kvantifikaci a/nebo detekci vzácných cílů. Její výhodou je, v porovnání s qPCR, přesnější kvantifikace nezávislá na počtu amplifikačních cyklů a kalibrační křivce.

Polymerase chain reaction (PCR) is a technique used to amplify a specific DNA segment. For its qualities, this technique has become popular and widely used method in practise. Nowaday, we distinguish three generations of PCR – traditional PCR (1st Generation), quantitative PCR with fluorescence detection – qPCR (2nd generation) and digital PCR – dPCR (3rd generation). dPCR is robust and sensitive method, which is applied in many fields such as microbiology, food analysis, oncology, etc. It is mainly used for absolute quantification and / or detection of rare targets. Its advantage, in comparison to qPCR, is more precise quantification independent of the number of amplification cycles and the calibration curve.

• Klíčová slova
• digitální PCR,
• MeSH
• DNA MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
• multiplexová polymerázová řetězová reakce metody   MeSH
• polymerázová řetězová reakce klasifikace   metody   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• techniky amplifikace nukleových kyselin MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

• MeSH
• chromozomální aberace MeSH
• dítě MeSH
• lidé MeSH
• lidské chromozomy, pár 13 MeSH
• lidské chromozomy, pár 18 MeSH
• lidské chromozomy, pár 21 MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• prenatální diagnóza MeSH
• Check Tag
• dítě MeSH
• lidé MeSH

Cílem práce bylo porovnání dosažených výsledků molekulárních metod využívaných v Oddělení bakteriálních vzdušných nákaz (OBVN) CEM SZÚ pro účely detekce, identifikace a typizace bakterií Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae a Haemophilus influenzae v klinických (kultivačně negativních) vzorcích při podezření na uvedená invazivní bakteriální onemocnění. OBVN nabízí využití molekulární diagnostiky uvedených bakteriálních původců menigitid a sepsí z klinických vzorků již řadu let. Spektrum metod se však změnilo. Z původní polymerázové řetězové reakce s elektroforetickým vyhodnocením (seminested PCR) k real-time polymerázové řetězové reakci (rt-PCR). Bylo provedeno souběžné srovnání obou metodik na 56 klinických vzorcích, které ukazuje lepší výsledky rt-PCR oproti seminested PCR.

The aim was to compare the outcomes of molecular methods used in the Unit for Airborne Bacterial Infections (UABI) for the detection, identification, and typing of the bacteria Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae from clinical culture-negative specimens of patients with suspected invasive bacterial infection. The UABI has been providing molecular diagnosis of the above-mentioned bacterial pathogens from clinical specimens of patients with meningitis or sepsis for years. However, the range of the methods used has changed: the UABI switched from the polymerase chain reaction (PCR) with reading of the results by elecrophoresis (seminested PCR) to the real-time polymerase chain reaction (rt-PCR). The outcomes of the two methods were compared using 56 clinical specimens, with rt-PCR proving superior to seminested PCR

• Klíčová slova
• seminested PCR, rt-PCR,
• MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• Haemophilus influenzae izolace a purifikace   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce statistika a číselné údaje   MeSH
• Neisseria meningitidis izolace a purifikace   MeSH
• polymerázová řetězová reakce * metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• Streptococcus pneumoniae izolace a purifikace   MeSH
• techniky typizace bakterií metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• Publikační typ
• srovnávací studie MeSH

PCR metoda se velmi krátce od svého objevení stala rutinní metodou molekulárně bio­logických výzkumných laboratoří a nepostradatelným nástrojem dia­gnostické medicíny. Za dobu svého využívání byla rozvinuta do řady variant, které specificky reagují na potřeby výzkumu a dia­gnostiky co do použitého vstupního materiálu a jeho množství, podmínek reakce a nově vyvinutých technologií. Předložená práce stručně shrnuje jednotlivé PCR přístupy s důrazem na jejich využití v onkologickém výzkumu a praxi.

Since its discovery, PCR has become a conventional method of molecular bio­logy research laboratories and an indispensable tool in dia­gnostic medicine. Multiple variants of the PCR technique were developed, which enable the analysis of different bio­logical materials at different amounts and reaction conditions. This article briefly summarizes the PCR approaches and points out their applications in oncological research and practice. Key words: polymerase chain reaction (PCR) – real‑time PCR – digital PCR – clinical oncology This work was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101), BBMRI_CZ (LM2010004), GACR 13-00956S and by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 10. 2. 2014 Accepted: 1. 4. 2014

• Klíčová slova
• digitální PCR,
• MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce * metody   MeSH
• lékařská onkologie MeSH
• lidé MeSH
• mutace genetika   MeSH
• nádory * diagnóza   genetika   MeSH
• polymerázová řetězová reakce * dějiny   metody   trendy   MeSH
• polymorfismus genetický genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

• MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• karcinoembryonální antigen diagnostické užití   MeSH
• lidé MeSH
• metastázy nádorů diagnóza   MeSH
• nádorové cirkulující buňky MeSH
• nádory kostní dřeně diagnóza   MeSH
• nádory prsu diagnóza   komplikace   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   využití   MeSH
• prospektivní studie MeSH
• reziduální nádor diagnóza   MeSH
• vyšetřování kostní dřeně metody   využití   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH