Sekvenování DNA patří již řadu let ke standardním postupům při molekulárně-genetických analýzách biologického materiálu. V medicíně nachází široké uplatnění, zejména v oblasti diagnostiky dědičných chorob a nádorových onemocnění, přičemž rozvoj DNA diagnostiky byl významně podpořen zveřejněním sekvence lidského genomu v roce 2001. V posledních několika letech dochází k rychlému technologickému rozvoji nových sekvenačních technologií, který umožnil vznik sekvenátorů nové generace („tzv. New Generation Sequencing“). Nové technologie založené na principu masivního paralelního sekvenování (např. Roche/454, Illumina Genome Analyzer IIx, Life Technologies SOLiD 3 a další) umožňují zásadní navýšení kapacity sekvenátorů a výrazné snížení ceny. Tento významný technologický pokrok umožnil rozvoj celogenomového sekvenování včetně analýz individuálních lidských genomů a nastartoval rozvoj personální genomiky. První osekvenované individuální lidské genomy patřily významným genetikům J. C. Venterovi (2007) a J. D. Watsonovi (2008), avšak rychle následovaly sekvenační analýzy dalších jedinců z různých etnik, které přinesly podstatné informace o interpersonálních rozdílech ve struktuře genomů (byly např. charakterizovány nukleotidové polymorfismy, delece a amplifikace úseků DNA). První významné aplikovatelné výsledky již přineslo sekvenování genomů nádorových buněk, např. akutní myeloidní leukémie. Ačkoli v současné době ještě nejsme schopni interpretovat význam všech detekovaných variant genomu, znamená možnost sekvenování individuálních lidských genomů zásadní zlom v DNA diagnostice i celé medicíně.

DNA sequencing has become a standard method widely used in molecular genetic analysis of biological materials. Its use in medicine is widespread, especially in diagnostics of inherited disorders and cancer related diseases. Development of DNA diagnostics has been strongly accelerated by publication of the human genome sequence in 2001. During the last few years one can observe rapid development of novel sequencing technologies, which have led to the introduction of so called „New Generation Sequencing“. These new technologies based on principles of massive parallel sequencing (e.g. Roche/454, Illumina Genome Analyzer IIx, Life Technologies SOLiD 3 and others) enable a massive increase of sequencing capacity and in parallel also a fundamental decrease of costs. This major technological breakthrough allowed development of the whole-genome sequencing including analyses of individual human genomes. It also started the era of personal genomics. The first sequenced individual human genomes belonged to famous geneticists J. C. Venter (2007) and J. D. Watson (2008), but they were rapidly followed by sequencing analyses of other individuals from various ethnic groups. These studies brought substantial information about interpersonal differences in genome structure (through characterization of nucleotide polymorphisms, DNA deletions and amplifications etc.). Sequencing of cancer cell genomes, e.g. acute myeloid leukemia has already brought first important clinically relevant results. Although currently we are still unable to interpret the relevance of all detected genome variants, it is obvious, that the possibility to sequence individual human genomes represents a fundamental breakthrough not only in DNA diagnostics but also in clinical medicine.

• MeSH
• genom lidský MeSH
• genomika metody   MeSH
• lidé MeSH
• sekvenční analýza DNA MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• genom bakteriální MeSH
• komponenty genomu genetika   MeSH
• sekvenční analýza hybridizací s uspořádaným souborem oligonukleotidů metody   MeSH
• Treponema genetika   MeSH

• MeSH
• genom MeSH
• mapování chromozomů MeSH
• nukleotidy MeSH
• sekvence nukleotidů MeSH

• Konspekt
• Obecná genetika. Obecná cytogenetika. Evoluce
• NLK Obory
• genetika, lékařská genetika

Streptococcus pneumoniae (pneumokok) je grampozitivní kok vyvolávající jak neinvazivní, tak invazivní infekční onemocnění. Onemocnění vyvolaná pneumokokem mohou být preventabilní očkováním. Invazivní pneumokoková onemocnění (IPO) musí splňovat mezinárodní definici případu, jsou hlášena na národní i mezinárodní úrovni a v řadě zemí, včetně České republiky, jsou sledována v programu surveillance. Důležitou součástí surveillance IPO je sledování vyskytujících se sérotypů, hodnocení četnosti jednotlivých sérotypů v čase a v relaci k probíhajícím vakcinačním programům. Ve světe i v České republice je u pneumokoků stále častěji prováděna metoda celogenomové sekvenace (whole genome sequencing, WGS), která umožňuje určování sérotypu pneumokoků ze sekvenačních dat, dále přesnou analýzu jejich genetických vztahů a studium genů obsažených v jejich genomu. Celogenomová sekvenace umožňuje získávat spolehlivá a mezinárodně srovnatelná sekvenační data, která lze snadno sdílet. Sekvenační data jsou analyzována pomocí bioinformatických nástrojů, které vyžadují znalosti z oblasti přírodních věd s důrazem na genetiku a znalosti z oblasti bioinformatiky. V publikaci jsou představeny některé možnosti analýzy pneumokoka, kterými jsou sérotypizace, multilokusová sekvenační typizace (MLST), ribozomální MLST (rMLST), core genome MLST (cgMLST), whole genome MLST (wgMLST), single nucleotide polymorphism (SNP) analýza, určení Global Pneumococcal Sequence Cluster (GPSC), stanovení genů virulence a genů antibiotické rezistence. U metody WGS je prezentována strategie její aplikace v Evropě a realizace v praxi. Analýza pneumokoků metodou WGS představuje zlepšení v provádění surveillance IPO, kdy je sérotyp určován molekulárně geneticky, jsou prováděny další podrobnější typizace, získaná data lze snadno mezinárodně porovnávat a lze lépe hodnotit účinnost vakcinačních programů.

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a Gram-positive coccus causing both non-invasive and invasive infectious diseases. Pneumococcal diseases are vaccine preventable. Invasive pneumococcal diseases (IPD) meeting the international case definition are reported nationally and internationally and are subject to surveillance programmes in many countries, including the Czech Republic. An important part of IPD surveillance is the monitoring of causative serotypes and their frequency over time and in relation to ongoing vaccination programmes. In the world and in the Czech Republic, whole genome sequencing (WGS) is increasingly used for pneumococci, which allows for serotyping from sequencing data, precise analysis of their genetic relationships, and the study of genes present in their genome. Whole-genome sequencing enables the generation of reliable and internationally comparable data that can be easily shared. Sequencing data are analysed using bioinformatics tools that require knowledge in the field of natural sciences with an emphasis on genetics and expertise in bioinformatics. This publication presents some options for pneumococcal analysis, i.e., serotyping, multilocus sequence typing (MLST), ribosomal MLST (rMLST), core genome MLST (cgMLST), whole genome MLST (wgMLST), single nucleotide polymorphism (SNP) analysis, assignment to Global Pneumococcal Sequence Cluster (GPSC), and identification of virulence genes and antibiotic resistance genes. The WGS strategies and applications for Europe and WGS implementation in practice are presented. WGS analysis of pneumococci allows for improved IPD surveillance, thanks to molecular serotyping, more detailed typing, generation of internationally comparable data, and improved evaluation of the effectiveness of vaccination programmes.

• MeSH
• molekulární biologie metody   MeSH
• multilokusová sekvenční typizace klasifikace   metody   MeSH
• pneumokokové infekce mikrobiologie   MeSH
• sekvenování celého genomu * metody   normy   MeSH
• séroskupina MeSH
• sérotypizace klasifikace   metody   MeSH
• Streptococcus pneumoniae * genetika   izolace a purifikace   MeSH
• techniky typizace bakterií klasifikace   MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

In 2016, guidelines for diagnostic Next Generation Sequencing (NGS) have been published by EuroGentest in order to assist laboratories in the implementation and accreditation of NGS in a diagnostic setting. These guidelines mainly focused on Whole Exome Sequencing (WES) and targeted (gene panels) sequencing detecting small germline variants (Single Nucleotide Variants (SNVs) and insertions/deletions (indels)). Since then, Whole Genome Sequencing (WGS) has been increasingly introduced in the diagnosis of rare diseases as WGS allows the simultaneous detection of SNVs, Structural Variants (SVs) and other types of variants such as repeat expansions. The use of WGS in diagnostics warrants the re-evaluation and update of previously published guidelines. This work was jointly initiated by EuroGentest and the Horizon2020 project Solve-RD. Statements from the 2016 guidelines have been reviewed in the context of WGS and updated where necessary. The aim of these recommendations is primarily to list the points to consider for clinical (laboratory) geneticists, bioinformaticians, and (non-)geneticists, to provide technical advice, aid clinical decision-making and the reporting of the results.

• MeSH
• exom * MeSH
• genom lidský * MeSH
• jednonukleotidový polymorfismus MeSH
• lidé MeSH
• sekvenování celého genomu MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody   MeSH
• vzácné nemoci diagnóza   genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

• MeSH
• Betacoronavirus MeSH
• COVID-19 MeSH
• epidemický výskyt choroby MeSH
• genom virový MeSH
• ochrana veřejného zdraví MeSH
• sekvenování celého genomu MeSH

• Konspekt
• Veřejné zdraví a hygiena
• NLK Obory
• veřejné zdravotnictví
• virologie
• NLK Publikační typ
• publikace WHO

Streptococcus pyogenes způsobuje rozličná lidská onemocnění od nekomplikovaných infekcí dýchacích cest a kůže až po vážná invazivní onemocnění, která mohou být doprovázena syndromem toxického šoku. Významnými faktory virulence vedle M proteinu kódovaného genem emm jsou pyrogenní exotoxiny, které se považují za superantigeny. V Národní referenční laboratoři pro streptokokové nákazy byly nově zavedeny bioinformatické nástroje pro zpracování dat z celogenomové sekvenace S. pyogenes. Použitím programu SRST2 a platformy BV-BRC byla analyzována WGS data 10 kmenů S. pyogenes izolovaných od pacientů s invazivním onemocněním a byly stanoveny emm typy, sekvenční typy a profily genů kódujících superantigeny. K sestavení sekvencí genomů z krátkých čtení byla zvolena assembly pipeline Unicycler s de novo assemblerem SPAdes.

Streptococcus pyogenes causes a variety of human diseases ranging from uncomplicated respiratory tract and skin infections to severe invasive diseases possibly involving toxic shock syndrome. Besides the emm gene-encoded M protein, important virulence factors are pyrogenic exotoxins, referred to as superantigens. The National Reference Laboratory for Streptococcal Infections has newly introduced bioinformatics tools for processing S. pyogenes whole genome sequencing data. Using the SRST2 software and BV-BRC platform, WGS data of 10 S. pyogenes isolates from patients with invasive disease were analysed, and emm type, sequence type, and superantigen encoding gene profiles were determined. The Unicycler assembly pipeline with the SPAdes de novo assembler was used to assemble genome sequences from short reads.

• MeSH
• klinická studie jako téma MeSH
• klinické laboratorní techniky metody   MeSH
• lidé MeSH
• sekvenování celého genomu metody   MeSH
• Streptococcus pyogenes genetika   izolace a purifikace   patogenita   MeSH
• superantigeny * analýza   genetika   izolace a purifikace   klasifikace   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

The lack of samples for generating standardized DNA datasets for setting up a sequencing pipeline or benchmarking the performance of different algorithms limits the implementation and uptake of cancer genomics. Here, we describe reference call sets obtained from paired tumor-normal genomic DNA (gDNA) samples derived from a breast cancer cell line-which is highly heterogeneous, with an aneuploid genome, and enriched in somatic alterations-and a matched lymphoblastoid cell line. We partially validated both somatic mutations and germline variants in these call sets via whole-exome sequencing (WES) with different sequencing platforms and targeted sequencing with >2,000-fold coverage, spanning 82% of genomic regions with high confidence. Although the gDNA reference samples are not representative of primary cancer cells from a clinical sample, when setting up a sequencing pipeline, they not only minimize potential biases from technologies, assays and informatics but also provide a unique resource for benchmarking 'tumor-only' or 'matched tumor-normal' analyses.

• MeSH
• benchmarking * MeSH
• datové soubory jako téma MeSH
• lidé MeSH
• mutace MeSH
• mutační analýza DNA normy   MeSH
• nádorové buněčné linie MeSH
• nádory prsu genetika   MeSH
• referenční standardy MeSH
• reprodukovatelnost výsledků MeSH
• sekvenování celého genomu normy   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování normy   MeSH
• zárodečné buňky MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• Research Support, N.I.H., Extramural MeSH

Tuberculosis (TB) is considered one of the most serious infectious diseases worldwide. Effective control of tuberculosis infection involves multiple steps, such as reliable detection, treatment, an epidemiological control as a part of case management, and further surveillance and monitoring of TB spread in the human population. Due to the accelerating advances in molecular biology, especially in DNA sequencing, in the past decade, the application of these methods has become crucial for TB evolution studies, differentiation of Mycobacterium tuberculosis genotypes, and their distribution. Currently, several molecular genetic methods are available. The oldest typing methods (e.g., IS6110-RFLP, spoligotyping, and MIRU-VNTR) can discover the chain of transmission to the patient. Currently, whole genome sequencing facilitates is furthermore able to identify the source of infection, the transmission trays among individuals sharing the same isolate, as well as determination of the TB evolution and its resistance to antituberculotic agents. It is obvious that this technique will become a new gold standard in genotyping methods in tuberculosis molecular epidemiological studies. In this article, molecular genetic typing methods with a special focus on whole genome sequencing and data management are reviewed.

• MeSH
• bakteriální léková rezistence genetika   MeSH
• fylogeografie MeSH
• genom bakteriální * MeSH
• genotyp MeSH
• lidé MeSH
• molekulární epidemiologie normy   MeSH
• molekulární typizace metody   normy   MeSH
• Mycobacterium tuberculosis klasifikace   genetika   MeSH
• sekvenování celého genomu * MeSH
• tuberkulóza diagnóza   epidemiologie   mikrobiologie   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• přehledy MeSH

Cíl práce: Ověření možnosti využití metody sekvenace celého genomu (WGS) v molekulární surveillance invazivního meningokokového onemocnění v České republice. Určení úspěšnosti nové metody při stanovování genových a proteinových variant a její porovnání s klasickými sekvenačními metodami. Materiál a metodiky: Pro celogenomovou sekvenaci byl vybrán soubor dvaceti izolátů N. meningitidis z invazivních meningokokových onemocnění, která byla zachycena v České republice v roce 2015. WGS proběhla na platformě Illumina MiSeq. Celogenomová data byla upravena pomocí softwaru Velvet de novo Assembler a výsledné genomové kontigy byly poslány do Neisseria PubMLST webové databáze obsahující alelové a genomické údaje kmenů rodu Neisseria. Analýza a vzájemné porovnání genomů proběhlo s využitím BIGSdb Genome Comparator, který je součástí databáze PubMLST. Data WGS byla porovnána na několika úrovních rozlišení: MLST (Multi Locus Sequence Typing), rMLST (ribozomální MLST), cgMLST (core genome MLST) a “all loci“ tj. všech definovaných genů pro N. meningitidis v databázi PubMLST k 6. 11. 2017 (3 028 lokusů). Metodou WGS byla provedena detailní charakterizace genů antigenů zařazených do vakcín proti N. meningitidis B. Výsledky: Nová metoda WGS poskytla detailní charakterizaci izolátů N. meningitidis, která zpřesnila předchozí výsledky získané klasickými sekvenačními metodami. Kvalitnější WGS data umožnila identifikaci nových alel a nových sekvenačních typů, které nebyly klasickými sekvenačními metodami rozpoznány. Analýza genetické diverzity potvrdila vyšší příbuznost mezi izoláty, které patří k jednomu klonálnímu komplexu. Nejpřesnější informace o genetické diverzitě izolátů poskytlo srovnání dat WGS na úrovni schémat cgMLST a “all loci“. Byla zjištěna vzdálená příbuznost tří klonálních komplexů (cc32, cc35 a cc269). WGS data také poskytla přesnější informace o pokrytí izolátů novými vakcínami proti N. meningitidis B, ve srovnání s klasickou sekvenací. Závěry: WGS metoda prokázala vyšší diskriminační možnosti a přesnější určení genetických vlastností N. meningitidis. Zařazení metody WGS do rutinní molekulární surveillance invazivního meningokokového onemocnění v České republice je žádoucí.

Aim: To test the potential of whole genome sequencing (WGS) for molecular surveillance of invasive meningococcal disease in the Czech Republic. To check the success of the new method in the identification of gene and protein variants and to compare the outcomes between WGS and conventional sequencing methods. Material and methods: WGS was carried out in a set of 20 N. meningitidis isolates from invasive meningococcal disease cases in the Czech Republic in 2015. WGS was performed using the Illumina MiSeq platform. The WGS data were processed by the Velvet de novo Assembler software, and the resultant genome contigs were submitted to the Neisseria PubMLST web database containing allelic and genomic data on strains of the genus Neisseria. The genomes were analysed and compared using the BIGSdb Genome Comparator, which is part of the PubMLST database. WGS data were compared at several levels of resolution: MLST (Multi Locus Sequence Typing), rMLST (ribosomal MLST), cgMLST (core genome MLST), and “all loci“ i.e. all genes of N. meningitidis defined in the PubMLST database by 6 November 2017 (3028 loci). The WGS method was used to characterise in detail the genes of antigens involved in vaccines against N. meningitidis B. Results: The new WGS method provided detailed characteristics of N. meningitidis isolates, which improved the results obtained previously by conventional sequencing methods. High quality WGS data made it possible to identify novel alleles and novel sequence types that could not be recognized by conventional sequencing methods. The analysis of genetic diversity confirmed closer relatedness between isolates belonging to the same clonal complex. The most accurate information on genetic diversity of isolates was obtained by the comparison of WGS data at the cgMLST and “all loci“ levels. Distant relatedness of three clonal complexes (cc32, cc35, and cc269) was found. WGS data also provided more accurate information on the coverage of isolates by MenB vaccines in comparison with conventional sequencing data. Conclusions: The WGS method showed a higher discrimination potential and allowed a more accurate determination of genetic characteristics of N. meningitidis. The integration of the WGS method in routine molecular surveillance of invasive meningococcal disease in the Czech Republic is desirable.

• MeSH
• antigeny bakteriální genetika   imunologie   MeSH
• epidemiologické monitorování MeSH
• lidé MeSH
• meningokokové infekce * epidemiologie   genetika   imunologie   MeSH
• meningokokové vakcíny klasifikace   terapeutické užití   MeSH
• Neisseria meningitidis genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• sekvenování celého genomu * MeSH
• zobrazování dat MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH