Next generation sequencing
Dotaz
Zobrazit nápovědu
Sekvenování nové generace, nazývané také masivně paralelní sekvenování (MPS), je v současnosti nejrychleji se rozvíjející metodou molekulární genetiky, která přinese zlom v oblasti personalizované medicíny. V tomto přehledu stručně popisujeme hlavní typy MPS, kterými jsou celogenomová a exomová sekvenace, sekvenace transkriptomu a amplikonové sekvenování. Dále je uveden souhrn výhod, nevýhod a možných aplikací technologií nabízených v současnosti v České republice.
Next generation or massive parallel sequencing (MPS) is a rapidly advancing method in molecular genetics that will bring significant changes in the personalized medicine field. In this review we briefly describe major types of MPS, including whole-genome, -exome, -transcriptome and amplicon sequencing. We also present an overview of the advantages, drawbacks and possible applications of sequencing technologies available in the Czech Republic.
- Klíčová slova
- masivně paralelní sekvenování, amplikonové sekvenování, sekvenování nové generace,
- MeSH
- exom MeSH
- lidé MeSH
- sekvenční analýza DNA * ekonomika přístrojové vybavení trendy MeSH
- sekvenční analýza RNA metody MeSH
- transkriptom MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování * ekonomika metody přístrojové vybavení MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
Metagenomic high-throughput sequencing (mHTS) is a hypothesis-free, universal pathogen detection technique for determination of the DNA/RNA sequences in a variety of sample types and infectious syndromes. mHTS is still in its early stages of translating into clinical application. To support the development, implementation and standardization of mHTS procedures for virus diagnostics, the European Society for Clinical Virology (ESCV) Network on Next-Generation Sequencing (ENNGS) has been established. The aim of ENNGS is to bring together professionals involved in mHTS for viral diagnostics to share methodologies and experiences, and to develop application recommendations. This manuscript aims to provide practical recommendations for the wet lab procedures necessary for implementation of mHTS for virus diagnostics and to give recommendations for development and validation of laboratory methods, including mHTS quality assurance, control and quality assessment protocols.
- MeSH
- metagenomika * MeSH
- viry * genetika MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
Metoda masivně paralelního sekvenování umožnila rychlejší a ekonomičtější výzkum v oblasti genomiky. Tato technologie umožňuje osekvenovat kompletní lidský genom za zlomek ceny i času v porovnání s doposud používanou Sangerovou metodou. Zavedení této techniky do oblasti onkologického výzkumu významně přispělo k molekulární charakterizaci nádorů a hlubšímu porozumění jejich evoluce. Pomocí masivně paralelního sekvenování byly identifikovány nové kauzální mutace, které jsou podstatou nádorových dědičných syndromů, porovnáním sekvenování DNA nádorové a příslušné zdravé tkáně byly odhaleny nové mutace a strukturní aberace u více než 15 rozdílných nádorových onemocnění. V tomto přehledu jsou uvedeny technické charakteristiky nejrozšířenějších sekvenačních platforem, krátce shrnuty jejich výhody a nevýhody a popsány možnosti uplatnění v klinické praxi.
Development of new sequencing methods allowed faster and more economical genomic research. With these technologies, it is now possible to determine the complete sequence of human genome in a short time period and at a relatively low cost. Introduction of next generation sequencing methods to cancer research provided a comprehensive molecular characterization of cancers and enabled deeper insights into tumor complexity, heterogeneity and evolution. Next generation technologies have been applied to identify new causal mutations in genes in hereditary cancer syndromes. More than 15 various tumor types have been already sequenced and compared to that of normal cells allowing identification of new cancer driving mutations and genome structural rearrangements. In this review, we describe technical characteristics of main next generation sequencing platforms, briefly overview their pros and cons and clinical perspective. Key words: high‑throughput nucleotide sequencing – genomics – mutations – cancer research – clinical application – personalized treatment This work was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) and by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 4. 2. 2014 Accepted: 1. 4. 2014
- Klíčová slova
- technologie masivně paralelního sekvenování, onkologický výzkum, Roche 454, SOLiD, single-molecule sekvenování, Solexa,
- MeSH
- genetické testování MeSH
- genom lidský MeSH
- genomika * metody MeSH
- individualizovaná medicína MeSH
- lidé MeSH
- mutace * genetika MeSH
- nádory * diagnóza genetika MeSH
- sekvenční analýza DNA metody MeSH
- sekvenční analýza RNA metody MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování * metody přístrojové vybavení MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Molekulární metody pro detekci translokací byly postupně začleněny do rutinní diagnostiky nádorových onemocnění. Konvenční metody, jako je fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a reverzně transkriptázová-PCR, však mají i některé nevýhody. Sekvenování nové generace (NGS) může poskytnout citlivou detekci alterací mnoha genů. RNA NGS na principu Anchored multiplex PCR se ukázalo jako rychlý a snadno analyzovatelný přístup pro laboratoře rutinní diagnostiky. Archer FusionPlex panely jsou přínosné jak v diagnostice nádorů, tak v identifikaci nových fúzních genů. NGS je užitečný nástroj při identifikaci cílitelných molekulárních změn (bodové mutace, fúzní geny atd.). U pacientů s pokročilým onemocněním může NGS napomoci k zařazení těchto pacientů k léčbě na základě stanovení rizikových markerů (risk udapted therapy) a/nebo při průkazu léčebného cíle k cílené léčbě.
Molecular assays for translocation detection in different tumors have gradually been incorporated into routine diagnostics. However, conventional methods such as fluorescence in situ hybridization (FISH) and reverse transcriptase-PCR come with several drawbacks. Next-generation sequencing (NGS) can provide in-depth detection of numerous gene alterations. The anchored multiplex PCR assay proved to be a fast and easy-to-analyze approach for routine diagnostics laboratories. Next-generation sequencing-based anchored multiplex PCR technique (Archer FusionPlex Panels) is beneficial in both diagnosis for patient care and in identification of a novel fusion breakpoint in tumors. NGS is useful in identifying targetable molecular changes (point mutations, fusion genes, etc.) in tumors that can serve as a rationale for inclusion of patients with advanced disease in ongoing clinical trials and allow for better risk stratification.
- Klíčová slova
- fúzní geny,
- MeSH
- cílená molekulární terapie MeSH
- diagnostické zobrazování MeSH
- dítě MeSH
- dospělí MeSH
- lidé MeSH
- nádory * diagnóza terapie MeSH
- předškolní dítě MeSH
- výsledek terapie MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování * metody MeSH
- Check Tag
- dítě MeSH
- dospělí MeSH
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- předškolní dítě MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- Publikační typ
- kazuistiky MeSH
- přehledy MeSH
V technologiích sekvenování nukleových kyselin došlo v posledních letech k výraznému pokroku a použití těchto metod se pomalu, ale jistě, dostává do běžné praxe klinických onkologů. Sekvenování nové generace (next-generation sequencing, NGS) je relativně rychlou a spolehlivou metodou a v poslední době se zlepšuje i cenová dostupnost.1 Pro personalizovanou onkologii, jejíž základní ideou je predikovat odpověď na cílenou terapii (targeted therapy) na základě molekulárních markerů nezávisle na histologickém nálezu, je znalost základních molekulárních metod nutností.2 Proto v tomto článku chceme přiblížit klinickým onkologům možnosti, které nabízí NGS a jejich případné užití v praxi.
In sequencing technologies of nucleic acids, significant progress has been made in recent years, and the use of these methods is slowly but surely endorsed in the practice of clinical oncologists. Next-generation sequencing (NGS) is relatively fast and reliable method and nowadays it became to be also financially available.1 The main idea of personalized oncology is prediction of response to targeted treatment based on molecular markers independently to histological finding. And for this approach the understanding of molecular methods is necessary.2 Therefore, we decided to show possibilities of NGS and its implication to daily practice in this article.
Predoperačná cytopatologická diagnostika nádorov pankreatobiliárneho traktu je senzitívne a špecifické vyšetrenie, ktoré má nezastupiteľnú úlohu v manažmente týchto ochorení. Patológ by sa mal vždy pokúsiť stanoviť čo najpresnejšiu diagnózu a minimalizovať počet nejednoznačných diagnóz („atypické bunky“), ktoré spôsobujú v ďalšom manažmente dilemu. Diagnostická presnosť cytopatológie môže byť výrazne zlepšená rozumným použitím imunohistochémie a metód molekulovej genetiky. Najnovším diagnostickým nástrojom v pankreatobiliárnej cytopatológii je masívne paralelné sekvenovanie (next generation sequencing/NGS). NGS je robustná diagnostická metóda, ktorá navyše prináša informácie o prognóze a informácie potenciálne využiteľné pri výbere cielenej liečby.
Preoperative cytopathology of pancreatobiliary neoplastic lesions is a sensitive and specific method and is irreplaceable in the diagnosis and clinical management of these diseases. Pathologists should make every attempt to provide diagnosis as precise as possible and minimize the rate of “atypical” results, which create management dilemmas. The diagnostic accuracy of cytopathology can be significantly improved by judicious use of ancillary studies, including immunohistochemistry and molecular genetics. Next generation sequencing (NGS) is the latest addition to pancreatobiliary cytopathology diagnostic arsenal. NGS is not only a very robust diagnostic tool, but also carries significant prognostic and therapeutic information.
Neuromuskulární onemocnění (NMD) jsou klinicky a geneticky heterogenní skupinou onemocnění. V současné době je identifikováno 608 genů asociovaných s různými typy NMD. Většina těchto onemocnění se řadí mezi vzácná s velmi nízkou prevalencí. Pokrok v identifikaci genů asociovaných s NMD lze připsat technologickému vývoji v oblasti sekvenování nové generace (NGS) a cenové dostupnosti tohoto metodického přístupu. Z hlediska šíře analyzované DNA je možné aplikace NGS rozdělit na analýzu (a) vybraného souboru genů, (b) exomu a (c) genomu. Identifikace patogenních variant vede k výraznému posunu v chápání etiopatogeneze onemocnění, umožňuje predikci průběhu onemocnění, event. jeho cílenou léčbu, která může být specifická pro jednotlivé typy NMD nebo dokonce pro jednotlivé patogenní sekvenční varianty.
Neuromuscular diseases (NMDs) are a clinically and genetically heterogeneous group of diseases. Currently, 608 genes associated with different types of NMD have been identified. Most of these diseases are rare with a very low prevalence. Advance in the identification of genes associated with NMD can be attributed to technological development in an area of next generation sequencing (NGS) and the affordability of this methodical approach. NGS applications can be divided into analysis of (a) a selected set of genes, (b) an exom, and (c) a genome. The identification of pathogenic variants leads to a significant shift in the understanding of the etiopathogenesis of the disease, allows the prediction of the course of the disease, or its targeted treatment, which may be specific for individual types of NMD or even for particular pathogenic sequence variants.
- MeSH
- lidé MeSH
- neuromuskulární nemoci diagnóza MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování * MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
Technologie sekvenování DNA nové generace mají v současné době nezastupitelné místo ve výzkumu a postupně nacházejí cestu i do oblasti klinické praxe. Sekvenační přístroje produkují velké množství dat, jejichž analýza metodami bioinformatiky je nezbytná k získání relevantních výsledků. Sekvenování se tak bez pokročilého výpočetního zpracování specializovanými algoritmy naprosto neobejde. V tomto přehledu jsou představeny základní koncepty výpočetního zpracování sekvenačních dat s přihlédnutím ke specifickým aspektům oblasti onkologie. Rovněž jsou uvedeny nejčastější problémy a překážky komplikující zpracování a biologickou interpretaci výsledků.
Next-generation sequencing technologies are currently well‑established in the research field and progressively find their way towards clinical applications. Sequencers produce vast amounts of data and therefore bioinformatics methods are needed for processing. Without computational methods, sequencing would not be able to produce relevant biological information. In this review, we introduce the basics of common NGS‑related bioinformatics methods used in oncological research. We also state some of the common problems complicating data processing and interpretation of the results. Key words: bioinformatics – high‑throughput nucleotide sequencing – mutations – cancer research – clinical application This study was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101), by the project MEYS – NPS I – LO1413, MH CZ – DRO (MMCI, 00209805) and BBMRI_CZ (LM2010004). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 21. 4. 2015 Accepted: 26. 6. 2015
- Klíčová slova
- technologie masivně paralelního sekvenování, referenční genom,
- MeSH
- genom MeSH
- interpretace statistických dat MeSH
- lidé MeSH
- nádory genetika MeSH
- výpočetní biologie * MeSH
- vysoce účinné nukleotidové sekvenování * metody MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
V posledním desetiletí došlo k dramatickému rozvoji molekulárně genetických metod. Zejména sekvenování nové generace – NGS se stalo finančně i technicky běžně dostupným vyšetřením, takže se začíná dostávat do klinické praxe mnoha specializací, onkologii nevyjímaje. Aplikace těchto metod a jejich správné používání je cestou k personalizované onkologii, tedy terapii pacienta na základě výskytu konkrétních genetických aberaci, kterou jsou prokázány v jeho nádorovém onemocnění, a to nezávisle na histopatologickém typu nádoru. Tento princip je v onkologii zcela nový a přináší řadu otázek a problémů. Samotná interpretace výsledků molekulárně genetických vyšetření je velmi náročná, a proto vznikají nové multidisciplinární týmy tzv. molekulární tumor boardy. Aktuálně probíhá celosvětová standardizace těchto boardů. Také doporučení ohledně indikace NGS vyšetření u onkologických pacientů se postupně nastavují, a to na celoevropské úrovni v podobě ESMO doporučení, tak na úrovni národní. Personalizovaná onkologie je budoucností tohoto oboru, která povede k nejlepší léčebné odpověď a minimalizaci nežádoucích účinků.
Molecular genetic methods have evolved dramatically in the last decade. In particular, sequencing of the new generation - NGS has become a financially and technically available examination. Thus, it begins to be used in the clinical practice of many specializations, including oncology. The proper use of these methods is a way to personalized oncology – treatment of the patient based on the occurrence of specific genetic aberrations, which are confirmed in his cancer, regardless of the histopathological type of tumor. This principle is completely new in oncology and raises number of questions and problems. The interpretation of the results of molecular genetic examinations is very complex and demanding, and therefore new multidisciplinary teams, so-called molecular tumor boards, are being created. The worldwide standardization of these boards is currently underway. Recommendations regarding the indication of NGS examinations in oncology patients are also being set.At the European level in the form of ESMO recommendations and at the national level also. Personalized oncology is the future of this field, which will lead to the best treatment response and minimize side effects.
