• MeSH
• Betacoronavirus MeSH
• COVID-19 MeSH
• epidemický výskyt choroby MeSH
• genom virový MeSH
• ochrana veřejného zdraví MeSH
• sekvenování celého genomu MeSH

• Konspekt
• Veřejné zdraví a hygiena
• NLK Obory
• veřejné zdravotnictví
• virologie
• NLK Publikační typ
• publikace WHO

Východiska: Nádorový genom dětských pacientů se vyznačuje řadou charakteristik, které jej značně odlišují od malignit dospělého věku. Mezi tyto charakteristiky patří nízká mutační nálož, významná role epigenetických změn a také četnost výskytu fúzních genů jakožto řídicích prvků kancerogeneze. Fúzní geny vznikají v důsledku několika typů chromozomálních přestaveb, jako jsou translokace, delece, inzerce či inverze, a mohou mít celou řadu funkčních dopadů. Ačkoli byly v minulosti studovány především v kontextu hematologických malignit, jejich význam v diagnostice a terapii solidních nádorů neustále narůstá. Materiál a metody: U 250 pacientů se solidními nádory z Kliniky dětské onkologie Fakultní nemocnice Brno byla provedena analýza fúzních genů metodou cíleného RNA sekvenování. Sekvenační knihovny byly připraveny s pomocí sady TruSight RNA Pan-Cancer Panel (Illumina, USA), který pokrývá 1385 klinicky relevantních genů. Sekvenace knihoven proběhla s využitím NextSeq Mid Output Kit (150 cyklů) na platformě NextSeq 500 (Illumina, USA). Sekvenační čtení byla namapována na referenční genom hg38 s pomocí STAR aligneru s parametry nastavenými tak, aby umožnily detekci fúzních genů. Pro vyhledání fúzních genů byly použity nástroje Arriba a STARfusion a identifikované fúzní geny byly manuálně ověřeny v softwaru IGV. Výsledky: Klinicky relevantní fúzní geny byly identifikovány u 25 % pacientů. Největší podíl identifikovaných fúzí tvořily fúze asociované se sarkomy, jako jsou EWSR1-FLI1, PAX3-FOXO1 nebo SS18-SSX1/2. Druhou největší skupinu představovaly fúze typické pro nádory CNS, zejména KIAA1549-BRAF či jiné fúze aktivující Ras/MAPK signalizaci. U pacientky s renálním karcinomem byla identifikována dosud nepopsaná fúze DVL3-TFE3. Celkem 33 % identifikovaných fúzních genů bylo terapeuticky cílitelných a u 2/3 pacientů s terapeuticky cílitelnou fúzí byla nasazena odpovídající léčba. Závěr: Analýza fúzních genů má velký přínos v diagnostice, prognostické stratifikaci a terapeutickém plánování pediatrických onkologických pacientů. Použití vysokokapacitních přístupů, jako je RNA sekvenování, umožňuje identifikaci nových fúzních genů a tím také hlubší porozumění komplexním změnám doprovázejícím vznik a rozvoj nádorových onemocnění.

Background: Pediatric cancer genome significantly differs from the genome of adult malignancies and is characterized by low tumor mutational burden, the great importance of epigenetic changes, and also the frequent occurrence of fusion genes. Fusion genes arise as a result of several types of chromosomal rearrangements, such as translocations, deletions, insertions, or inversions, and can have a variety of functional impacts. In the past, they were studied mainly in the context of hematological malignancies; however, their importance in the diagnostics and therapy of solid tumors is increasing. Materials and methods: In 250 patients with solid tumors from the Department of Pediatric Oncology of University Hospital Brno, an analysis of fusion genes was performed using targeted RNA sequencing. Sequencing libraries were prepared using the TruSight RNA Pan-Cancer Panel (Illumina), which covers 1 385 clinically relevant genes, and sequenced using the NextSeq Mid Output Kit (150 cycles) on the NextSeq 500 platform (Illumina). Sequencing reads were mapped to hg38 using the STAR aligner with parameters set to allow fusion genes detection. Arriba and STARfusion tools were used to search for fusion genes, which were subsequently manually verified in the IGV software. Results: Clinically relevant fusion genes were identified in 25% of patients. The largest proportion of fusions identified were fusions associated with sarcomas, such as EWSR1-FLI1, PAX3-FOXO1, or SS18-SSX1/2. The second-largest group was represented by CNS tumor fusions, especially KIAA1549-BRAF or other Ras/MAPK-associated fusions. A previously undescribed DVL3-TFE3 fusion was identified in a renal carcinoma patient. 33% of the identified fusion genes were therapeutically targetable, and 2/3 of patients received corresponding treatment. Conclusion: The analysis of fusion genes is of great benefit in the diagnostics, prognostic stratification, and therapeutic planning of pediatric cancer patients. The use of high-throughput approaches such as RNA sequencing enables the identification of novel fusion genes as well as a deeper understanding of the complex changes that are involved in the development of the disease.

• MeSH
• dítě MeSH
• fúzní onkogenní proteiny analýza   genetika   MeSH
• klinická studie jako téma MeSH
• lidé MeSH
• nádory * diagnóza   genetika   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování * metody   MeSH
• Check Tag
• dítě MeSH
• lidé MeSH

Molekulární metody pro detekci translokací byly postupně začleněny do rutinní diagnostiky nádorových onemocnění. Konvenční metody, jako je fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a reverzně transkriptázová-PCR, však mají i některé nevýhody. Sekvenování nové generace (NGS) může poskytnout citlivou detekci alterací mnoha genů. RNA NGS na principu Anchored multiplex PCR se ukázalo jako rychlý a snadno analyzovatelný přístup pro laboratoře rutinní diagnostiky. Archer FusionPlex panely jsou přínosné jak v diagnostice nádorů, tak v identifikaci nových fúzních genů. NGS je užitečný nástroj při identifikaci cílitelných molekulárních změn (bodové mutace, fúzní geny atd.). U pacientů s pokročilým onemocněním může NGS napomoci k zařazení těchto pacientů k léčbě na základě stanovení rizikových markerů (risk udapted therapy) a/nebo při průkazu léčebného cíle k cílené léčbě.

Molecular assays for translocation detection in different tumors have gradually been incorporated into routine diagnostics. However, conventional methods such as fluorescence in situ hybridization (FISH) and reverse transcriptase-PCR come with several drawbacks. Next-generation sequencing (NGS) can provide in-depth detection of numerous gene alterations. The anchored multiplex PCR assay proved to be a fast and easy-to-analyze approach for routine diagnostics laboratories. Next-generation sequencing-based anchored multiplex PCR technique (Archer FusionPlex Panels) is beneficial in both diagnosis for patient care and in identification of a novel fusion breakpoint in tumors. NGS is useful in identifying targetable molecular changes (point mutations, fusion genes, etc.) in tumors that can serve as a rationale for inclusion of patients with advanced disease in ongoing clinical trials and allow for better risk stratification.

• Klíčová slova
• fúzní geny,
• MeSH
• cílená molekulární terapie MeSH
• diagnostické zobrazování MeSH
• dítě MeSH
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• nádory * diagnóza   terapie   MeSH
• předškolní dítě MeSH
• výsledek terapie MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování * metody   MeSH
• Check Tag
• dítě MeSH
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• předškolní dítě MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• kazuistiky MeSH
• přehledy MeSH

V technologiích sekvenování nukleových kyselin došlo v posledních letech k výraznému pokroku a použití těchto metod se pomalu, ale jistě, dostává do běžné praxe klinických onkologů. Sekvenování nové generace (next-generation sequencing, NGS) je relativně rychlou a spolehlivou metodou a v poslední době se zlepšuje i cenová dostupnost.1 Pro personalizovanou onkologii, jejíž základní ideou je predikovat odpověď na cílenou terapii (targeted therapy) na základě molekulárních markerů nezávisle na histologickém nálezu, je znalost základních molekulárních metod nutností.2 Proto v tomto článku chceme přiblížit klinickým onkologům možnosti, které nabízí NGS a jejich případné užití v praxi.

In sequencing technologies of nucleic acids, significant progress has been made in recent years, and the use of these methods is slowly but surely endorsed in the practice of clinical oncologists. Next-generation sequencing (NGS) is relatively fast and reliable method and nowadays it became to be also financially available.1 The main idea of personalized oncology is prediction of response to targeted treatment based on molecular markers independently to histological finding. And for this approach the understanding of molecular methods is necessary.2 Therefore, we decided to show possibilities of NGS and its implication to daily practice in this article.

• MeSH
• analýza dat MeSH
• DNA genetika   MeSH
• lidé MeSH
• mutace genetika   MeSH
• nádory genetika   MeSH
• sekvenční analýza DNA * klasifikace   metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

The lack of samples for generating standardized DNA datasets for setting up a sequencing pipeline or benchmarking the performance of different algorithms limits the implementation and uptake of cancer genomics. Here, we describe reference call sets obtained from paired tumor-normal genomic DNA (gDNA) samples derived from a breast cancer cell line-which is highly heterogeneous, with an aneuploid genome, and enriched in somatic alterations-and a matched lymphoblastoid cell line. We partially validated both somatic mutations and germline variants in these call sets via whole-exome sequencing (WES) with different sequencing platforms and targeted sequencing with >2,000-fold coverage, spanning 82% of genomic regions with high confidence. Although the gDNA reference samples are not representative of primary cancer cells from a clinical sample, when setting up a sequencing pipeline, they not only minimize potential biases from technologies, assays and informatics but also provide a unique resource for benchmarking 'tumor-only' or 'matched tumor-normal' analyses.

• MeSH
• benchmarking * MeSH
• datové soubory jako téma MeSH
• lidé MeSH
• mutace MeSH
• mutační analýza DNA normy   MeSH
• nádorové buněčné linie MeSH
• nádory prsu genetika   MeSH
• referenční standardy MeSH
• reprodukovatelnost výsledků MeSH
• sekvenování celého genomu normy   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování normy   MeSH
• zárodečné buňky MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• Research Support, N.I.H., Extramural MeSH

Next-generation sequencing has revealed novel recurrent mutations in chronic lymphocytic leukemia, particularly in patients with aggressive disease. Here, we explored targeted re-sequencing as a novel strategy to assess the mutation status of genes with prognostic potential. To this end, we utilized HaloPlex targeted enrichment technology and designed a panel including nine genes: ATM, BIRC3, MYD88, NOTCH1, SF3B1 and TP53, which have been linked to the prognosis of chronic lymphocytic leukemia, and KLHL6, POT1 and XPO1, which are less characterized but were found to be recurrently mutated in various sequencing studies. A total of 188 chronic lymphocytic leukemia patients with poor prognostic features (unmutated IGHV, n=137; IGHV3-21 subset #2, n=51) were sequenced on the HiSeq 2000 and data were analyzed using well-established bioinformatics tools. Using a conservative cutoff of 10% for the mutant allele, we found that 114/180 (63%) patients carried at least one mutation, with mutations in ATM, BIRC3, NOTCH1, SF3B1 and TP53 accounting for 149/177 (84%) of all mutations. We selected 155 mutations for Sanger validation (variant allele frequency, 10-99%) and 93% (144/155) of mutations were confirmed; notably, all 11 discordant variants had a variant allele frequency between 11-27%, hence at the detection limit of conventional Sanger sequencing. Technical precision was assessed by repeating the entire HaloPlex procedure for 63 patients; concordance was found for 77/82 (94%) mutations. In summary, this study demonstrates that targeted next-generation sequencing is an accurate and reproducible technique potentially suitable for routine screening, eventually as a stand-alone test without the need for confirmation by Sanger sequencing.

• MeSH
• alely MeSH
• chronická lymfatická leukemie diagnóza   genetika   metabolismus   patologie   MeSH
• exprese genu MeSH
• fosfoproteiny genetika   metabolismus   MeSH
• frekvence genu MeSH
• lidé MeSH
• malý jaderný ribonukleoprotein U2 genetika   metabolismus   MeSH
• mutace * MeSH
• myeloidní diferenciační faktor 88 genetika   metabolismus   MeSH
• nádorové proteiny genetika   metabolismus   MeSH
• nádorový supresorový protein p53 genetika   metabolismus   MeSH
• prognóza MeSH
• receptor Notch1 genetika   metabolismus   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování * MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

BACKGROUND: Colorectal cancer is still the second leading cause of cancer-related deaths and thus biomarkers allowing prediction of the resistance of patients to therapy and estimating their prognosis are needed. We designed a panel of 558 genes with pharmacogenomics records related to 5-fluorouracil resistance, genes important for sensitivity to other frequently used drugs, major oncodrivers, and actionable genes. We performed a target enrichment sequencing of DNA from tumors and matched blood samples of patients, and compared the results with patient prognosis stratified by systemic adjuvant chemotherapy. RESULTS: The median number of detected variants per tumor sample was 18.5 with 4 classified as having a high predicted functional effect and 14.5 moderate effect. APC, TP53, and KRAS were the most frequent mutated genes (64%, 59%, and 42% of mutated samples, respectively) followed by FAT4 (23%), FBXW7, and PIK3CA (16% for both). Patients with advanced stage III had more frequently APC, TP53, or KRAS mutations than those in stages I or II. KRAS mutation counts followed an increasing trend with grade (G1 < G2 < G3). The response to adjuvant therapy was worse in carriers of frameshift mutations in APC or 12D variant in KRAS, but none of these oncodrivers had prognostic value. Carriage of somatic mutations in any of the genes ABCA13, ANK2, COL7A1, NAV3, or UNC80 had prognostic relevance for worse overall survival (OS) of all patients. In contrast, mutations in FLG, GLI3, or UNC80 were prognostic in the same direction for patients untreated, and mutations in COL6A3, LRP1B, NAV3, RYR1, RYR3, TCHH, or TENM4 for patients treated with adjuvant therapy. The first association was externally validated. From all germline variants with high or moderate predicted functional effects (median 326 per patient), > 5% frequency and positive Manhattan plot based on 3-year RFS, rs72753407 in NFACS, rs34621071 in ERBB4, and rs2444274 in RIF1 were significantly associated with RFS, OS or both. CONCLUSIONS: The present study identified several putative somatic and germline genetic events with prognostic potential for colorectal cancer that should undergo functional characterization.

• MeSH
• chemorezistence genetika   MeSH
• dospělí MeSH
• F-Box a WD repetice obsahující protein 7 genetika   MeSH
• farmakogenetika metody   MeSH
• fluoruracil terapeutické užití   MeSH
• fosfatidylinositol-3-kinasy třídy I MeSH
• kolorektální nádory * genetika   farmakoterapie   patologie   MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mutace genetika   MeSH
• nádorové biomarkery genetika   MeSH
• nádorový supresorový protein p53 genetika   MeSH
• prognóza MeSH
• protein familiární adenomatózní polypózy genetika   MeSH
• protoonkogenní proteiny p21(ras) genetika   MeSH
• senioři MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

V současné době jsme svědky rychlého pronikání neinvazivní prenatální diagnostiky do běžné praxe. V posledních dvou letech se na trhu objevilo mnoho typů testování cfDNA jak ve formě komerčních kitů, tak v podobě “home made” testů. Cílem našeho příspěvku je upozornit na významné principiální i kvalitativní rozdíly dostupných neinvazivních prenatálních testů (NIPT) z molekulárního i klinického pohledu.

Nowadays we are witnessing the rapid penetration of non-invasive prenatal diagnostics into routine practice. In the past two years many types of cfDNA tests both commercial kits and „homemade“ tests have appeared on the market. The aim of our contribution is to bring your attention to the significant differences in quality of available non-invasive tests (NIPT) from molecular and clinical perspective.

• Klíčová slova
• cílené sekvenování, masivně paralelní sekvenování, fetální frakce,
• MeSH
• Downův syndrom diagnóza   MeSH
• lidé MeSH
• neinvazivní prenatální testování MeSH
• plod MeSH
• prenatální diagnóza * klasifikace   metody   MeSH
• sekvenční analýza DNA * klasifikace   metody   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• těhotenství MeSH
• volné cirkulující nukleové kyseliny MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

The ABCA4 gene is the most frequently mutated Mendelian retinopathy-associated gene. Biallelic variants lead to a variety of phenotypes, however, for thousands of cases the underlying variants remain unknown. Here, we aim to shed further light on the missing heritability of ABCA4-associated retinopathy by analyzing a large cohort of macular dystrophy probands. A total of 858 probands were collected from 26 centers, of whom 722 carried no or one pathogenic ABCA4 variant, while 136 cases carried two ABCA4 alleles, one of which was a frequent mild variant, suggesting that deep-intronic variants (DIVs) or other cis-modifiers might have been missed. After single molecule molecular inversion probes (smMIPs)-based sequencing of the complete 128-kb ABCA4 locus, the effect of putative splice variants was assessed in vitro by midigene splice assays in HEK293T cells. The breakpoints of copy number variants (CNVs) were determined by junction PCR and Sanger sequencing. ABCA4 sequence analysis solved 207 of 520 (39.8%) naive or unsolved cases and 70 of 202 (34.7%) monoallelic cases, while additional causal variants were identified in 54 of 136 (39.7%) probands carrying two variants. Seven novel DIVs and six novel non-canonical splice site variants were detected in a total of 35 alleles and characterized, including the c.6283-321C>G variant leading to a complex splicing defect. Additionally, four novel CNVs were identified and characterized in five alleles. These results confirm that smMIPs-based sequencing of the complete ABCA4 gene provides a cost-effective method to genetically solve retinopathy cases and that several rare structural and splice altering defects remain undiscovered in Stargardt disease cases.

• MeSH
• ABC transportéry genetika   MeSH
• HEK293 buňky MeSH
• lidé MeSH
• makulární degenerace * genetika   MeSH
• mutace genetika   MeSH
• retinální dystrofie * genetika   MeSH
• sekvenční analýza MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

• Publikační typ
• abstrakt z konference MeSH