Technologie sekvenování DNA nové generace mají v současné době nezastupitelné místo ve výzkumu a postupně nacházejí cestu i do oblasti klinické praxe. Sekvenační přístroje produkují velké množství dat, jejichž analýza metodami bioinformatiky je nezbytná k získání relevantních výsledků. Sekvenování se tak bez pokročilého výpočetního zpracování specializovanými algoritmy naprosto neobejde. V tomto přehledu jsou představeny základní koncepty výpočetního zpracování sekvenačních dat s přihlédnutím ke specifickým aspektům oblasti onkologie. Rovněž jsou uvedeny nejčastější problémy a překážky komplikující zpracování a biologickou interpretaci výsledků.

Next-generation sequencing technologies are currently well‑established in the research field and progressively find their way towards clinical applications. Sequencers produce vast amounts of data and therefore bioinformatics methods are needed for processing. Without computational methods, sequencing would not be able to produce relevant biological information. In this review, we introduce the basics of common NGS‑related bioinformatics methods used in oncological research. We also state some of the common problems complicating data processing and interpretation of the results. Key words: bioinformatics – high‑throughput nucleotide sequencing – mutations – cancer research – clinical application This study was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101), by the project MEYS – NPS I – LO1413, MH CZ – DRO (MMCI, 00209805) and BBMRI_CZ (LM2010004). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 21. 4. 2015 Accepted: 26. 6. 2015

• Klíčová slova
• technologie masivně paralelního sekvenování, referenční genom,
• MeSH
• genom MeSH
• interpretace statistických dat MeSH
• lidé MeSH
• nádory genetika   MeSH
• výpočetní biologie * MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování * metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Metagenomic high-throughput sequencing (mHTS) is a hypothesis-free, universal pathogen detection technique for determination of the DNA/RNA sequences in a variety of sample types and infectious syndromes. mHTS is still in its early stages of translating into clinical application. To support the development, implementation and standardization of mHTS procedures for virus diagnostics, the European Society for Clinical Virology (ESCV) Network on Next-Generation Sequencing (ENNGS) has been established. The aim of ENNGS is to bring together professionals involved in mHTS for viral diagnostics to share methodologies and experiences, and to develop application recommendations. This manuscript aims to provide practical recommendations for the wet lab procedures necessary for implementation of mHTS for virus diagnostics and to give recommendations for development and validation of laboratory methods, including mHTS quality assurance, control and quality assessment protocols.

• MeSH
• metagenomika * MeSH
• viry * genetika   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

Sekvenování nové generace, nazývané také masivně paralelní sekvenování (MPS), je v současnosti nejrychleji se rozvíjející metodou molekulární genetiky, která přinese zlom v oblasti personalizované medicíny. V tomto přehledu stručně popisujeme hlavní typy MPS, kterými jsou celogenomová a exomová sekvenace, sekvenace transkriptomu a amplikonové sekvenování. Dále je uveden souhrn výhod, nevýhod a možných aplikací technologií nabízených v současnosti v České republice.

Next generation or massive parallel sequencing (MPS) is a rapidly advancing method in molecular genetics that will bring significant changes in the personalized medicine field. In this review we briefly describe major types of MPS, including whole-genome, -exome, -transcriptome and amplicon sequencing. We also present an overview of the advantages, drawbacks and possible applications of sequencing technologies available in the Czech Republic.

• Klíčová slova
• masivně paralelní sekvenování, amplikonové sekvenování, sekvenování nové generace,
• MeSH
• exom MeSH
• lidé MeSH
• sekvenční analýza DNA * ekonomika   přístrojové vybavení   trendy   MeSH
• sekvenční analýza RNA metody   MeSH
• transkriptom MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování * ekonomika   metody   přístrojové vybavení   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) patří mezi onemocnění, u nichž se po dlouhou dobu nedařilo identifikovat genové mutace, které souvisí s jejich vznikem a progresí. Nedostatečné pochopení patogeneze CLL zpomalovalo pokrok na poli cílené léčby. V nedávné době bylo publikováno několik klíčových prací, které s využitím přístupů „vysokokapacitního sekvenování nové generace“ (Next Generation Sequencing – NGS) popsaly mutace v cca 15 protein-kódujících genech potenciálně důležitých v biologii CLL. V následujícím přehledovém článku shrnujeme doposud získaná data a jejich relevanci pro patogenezi a prognózu CLL.

For a long time, there has been little success in identifying gene mutations responsible for disease onset and progression in chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Our insufficient understanding of CLL pathogenesis has impaired the development of targeted therapy. Several recent publications using Next Generation Sequencing technology have now identified mutations in approximately fifteen protein-coding genes that may be relevant for CLL biology. In this review, we summarize the data acquired thus far and its relative importance for CLL pathogenesis and prognosis.

• Klíčová slova
• CLL, SF3B1, NOTCH1, MYD88, sekvenování nové generace, NGS,
• MeSH
• analýza přežití MeSH
• chronická lymfatická leukemie diagnóza   genetika   MeSH
• diferenciační antigeny genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• financování organizované MeSH
• fosfoproteiny genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• genetický výzkum MeSH
• geny p53 genetika   imunologie   MeSH
• lidé MeSH
• malý jaderný ribonukleoprotein U2 genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• mutace genetika   imunologie   MeSH
• prognóza MeSH
• proteiny buněčného cyklu genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• receptor Notch1 genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• statistika jako téma MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody   využití   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

Abscesses are often clinically manifested as local necrotic tissues in various organs or systems of the human body, which is commonly caused by microbial infection. Rapid and accurate identification of pathogens from clinical abscetic samples would greatly guide a clinician to make the precise choices of the antimicrobial treatment. Here, this study aimed to investigate the application of metagenomic next-generation sequencing (mNGS) in the microbial detection of clinical samples of abscess fluids from various organs or systems. Nine patients with abscess from various organs or systems were enrolled in this study. The pathogenic bacteria in abscess fluid were detected and compared by the conventional bacterial culture and mNGS respectively. The dominant pathogens of abscess fluids in 8 cases can be found directly from mNGS, dominating over 80% of the total reads abundance of the microbiome. Although the pathogens from 6 cases detected by mNGS were consistent with that from the conventional bacteria culture method, the fastidious obligate anaerobic bacteria in 2 cases additionally detected by mNGS were not found by the conventional culture method. Moreover, complex polymicrobial infection containing Parvimonas micra in one case negatively with conventional bacterial culture were demonstrated by the mNGS method. And the mNGS method can directly reflect the diversity of microbial ecology in the abscess fluids from the different parts of the human body. Conclusively, mNGS can be used as a supplemental method for the pathogen detection of clinically abscess fluids.

• MeSH
• absces * diagnóza   MeSH
• Firmicutes MeSH
• lidé MeSH
• metagenomika * MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

Syndrom náhlého úmrtí kojence je definován jako náhlá a neočekávaná smrt kojence, kterou neobjasní detailní anamnéza, ohledání místa úmrtí ani pitva. Přestože mají tato úmrtí společný patogenetický mechanismus, ani recentní genetické analýzy založené na sekvenování nové generace jednotnou genetickou příčinu neodhalily. Přibližně u 10 % těchto kojenců lze vystopovat dominantní vliv patogenní varianty v jednom z řady kandidátních genů. Jedná se především o geny kódující iontové kanály v srdci, jejichž poruchy způsobují vrozené arytmické syndromy, například syndrom dlouhého QT intervalu nebo katechola-minergní polymorfní komorovou tachykardii. Jejich dědičnost je zpravidla autosomálně dominantní a existuje tedy zvýšené riziko onemocnění a náhlého úmrtí u prvostupňových příbuzných. Proto je v současné době doporučeno kardiologické vyšetření prvostupňových příbuzných zemřelého a genetické vyšetření post mortem zaměřené právě na vrozené arytmické syndromy. Mezi další kandidátní geny patří například geny pro sodíkové iontové kanály v respiračních kosterních svalech a v mozku, pro mineralokortikoidní receptor a geny kódující enzymy, které se podílejí na adrenální steroidogenezi. Interpretace molekulárně genetického vyšetření post mortem musí být velmi opatrná. Pouze skutečně patogenní nálezy, a to vždy v korelaci s klinickým nálezem u příbuzných, lze využít pro genetické poradenství v rodině.

Sudden infant death syndrome is defined as sudden and unexpected death of an infant that remains unexplained after thorough investigation of the scene of death, medical history and autopsy. Although a common final pathogenic pathway of these deaths is assumed, even recent studies based on next generation sequencing failed to reveal a single genetic cause. Predominant role of a pathogenic variant in one of the candidate genes may be traced in approximately 10% of these infants. The candidate genes include genes encoding ion channels in the heart that lead to inherited primary arrhythmia syndromes (cardiac channelopathies), for example long QT syndrome and catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Their inheritance is mostly autosomal dominant with an increased risk of the disease associated with sudden death for first-degree relatives. Therefore a thorough cardiological examination of first-degree relatives and post-mortem molecular testing of the cardiac channelopathies are recommended. Other candidate genes include genes for sodium channels in the respiratory skeletal muscles and brain or genes encoding mineralocorticoid receptor or enzymes involved in adrenal steroidogenesis. Results of post-mortem genetic testing, especially in cases of sudden infant death syndrome, must be interpreted with caution. Only strictly assessed pathogenic variants may be used for genetic counseling in the family, always in correlation with clinical findings.

• MeSH
• genetická predispozice k nemoci MeSH
• kojenec MeSH
• lidé MeSH
• náhlá smrt kojenců * genetika   MeSH
• srdeční arytmie genetika   MeSH
• vrozené srdeční vady genetika   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody   MeSH
• Check Tag
• kojenec MeSH
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Predoperačná cytopatologická diagnostika nádorov pankreatobiliárneho traktu je senzitívne a špecifické vyšetrenie, ktoré má nezastupiteľnú úlohu v manažmente týchto ochorení. Patológ by sa mal vždy pokúsiť stanoviť čo najpresnejšiu diagnózu a minimalizovať počet nejednoznačných diagnóz („atypické bunky“), ktoré spôsobujú v ďalšom manažmente dilemu. Diagnostická presnosť cytopatológie môže byť výrazne zlepšená rozumným použitím imunohistochémie a metód molekulovej genetiky. Najnovším diagnostickým nástrojom v pankreatobiliárnej cytopatológii je masívne paralelné sekvenovanie (next generation sequencing/NGS). NGS je robustná diagnostická metóda, ktorá navyše prináša informácie o prognóze a informácie potenciálne využiteľné pri výbere cielenej liečby.

Preoperative cytopathology of pancreatobiliary neoplastic lesions is a sensitive and specific method and is irreplaceable in the diagnosis and clinical management of these diseases. Pathologists should make every attempt to provide diagnosis as precise as possible and minimize the rate of “atypical” results, which create management dilemmas. The diagnostic accuracy of cytopathology can be significantly improved by judicious use of ancillary studies, including immunohistochemistry and molecular genetics. Next generation sequencing (NGS) is the latest addition to pancreatobiliary cytopathology diagnostic arsenal. NGS is not only a very robust diagnostic tool, but also carries significant prognostic and therapeutic information.

• MeSH
• biopsie metody   MeSH
• cytologické techniky metody   MeSH
• genetické testování metody   MeSH
• imunohistochemie metody   MeSH
• lidé MeSH
• nádory slinivky břišní * genetika   imunologie   patologie   MeSH
• nádory žlučových cest * genetika   imunologie   patologie   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

PURPOSE: Preimplantation genetic testing for monogenic disorders (PGT-M) allows early diagnosis in embryos conceived in vitro. PGT-M helps to prevent known genetic disorders in affected families and ensures that pathogenic variants in the male or female partner are not passed on to offspring. The trend in genetic testing of embryos is to provide a comprehensive platform that enables robust and reliable testing for the causal pathogenic variant(s), as well as chromosomal abnormalities that commonly occur in embryos. In this study, we describe PGT protocol that allows direct mutation testing, haplotyping, and aneuploidy screening. METHODS: Described PGT protocol called OneGene PGT allows direct mutation testing, haplotyping, and aneuploidy screening using next-generation sequencing (NGS). Whole genome amplification product is combined with multiplex PCR used for SNP enrichment. Dedicated bioinformatic tool enables mapping, genotype calling, and haplotyping of informative SNP markers. A commercial software was used for aneuploidy calling. RESULTS: OneGenePGT has been implemented for seven of the most common monogenic disorders, representing approximately 30% of all PGT-M indications at our IVF centre. The technique has been thoroughly validated, focusing on direct pathogenic variant testing, haplotype identification, and chromosome abnormality detection. Validation results show full concordance with Sanger sequencing and karyomapping, which were used as reference methods. CONCLUSION: OneGene PGT is a comprehensive, robust, and cost-effective method that can be established for any gene of interest. The technique is particularly suitable for common monogenic diseases, which can be performed based on a universal laboratory protocol without the need for set-up or pre-testing.

• MeSH
• aneuploidie MeSH
• blastocysta patologie   MeSH
• genetické testování metody   MeSH
• lidé MeSH
• mutace genetika   MeSH
• preimplantační diagnóza * metody   MeSH
• těhotenství MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

BACKGROUND: Current technologies in next-generation sequencing are offering high throughput reads at low costs, but still suffer from various sequencing errors. Although pyro- and ion semiconductor sequencing both have the advantage of delivering long and high quality reads, problems might occur when sequencing homopolymer-containing regions, since the repeating identical bases are going to incorporate during the same synthesis cycle, which leads to uncertainty in base calling. The aim of this study was to evaluate the analytical performance of a pyrosequencing-based next-generation sequencing system in detecting homopolymer sequences using homopolymer-preintegrated plasmid constructs and human DNA samples originating from patients with cystic fibrosis. RESULTS: In the plasmid system average correct genotyping was 95.8% in 4-mers, 87.4% in 5-mers and 72.1% in 6-mers. Despite the experienced low genotyping accuracy in 5- and 6-mers, it was possible to generate amplicons with more than a 90% adequate detection rate in every homopolymer tract. When homopolymers in the CFTR gene were sequenced average accuracy was 89.3%, but varied in a wide range (52.2 - 99.1%). In all but one case, an optimal amplicon-sequencing primer combination could be identified. In that single case (7A tract in exon 14 (c.2046_2052)), none of the tested primer sets produced the required analytical performance. CONCLUSIONS: Our results show that pyrosequencing is the most reliable in case of 4-mers and as homopolymer length gradually increases, accuracy deteriorates. With careful primer selection, the NGS system was able to correctly genotype all but one of the homopolymers in the CFTR gene. In conclusion, we configured a plasmid test system that can be used to assess genotyping accuracy of NGS devices and developed an accurate NGS assay for the molecular diagnosis of CF using self-designed primers for amplification and sequencing.

• MeSH
• cystická fibróza genetika   MeSH
• lidé MeSH
• plazmidy MeSH
• protein CFTR genetika   MeSH
• sekvenční analýza DNA metody   MeSH
• tandemové repetitivní sekvence * MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• validační studie MeSH

• Publikační typ
• abstrakt z konference MeSH