quantitative PCR Dotaz Zobrazit nápovědu
Východisko. Kvantifikace fluorescenčně značených PCR produktů na kapilární elektroforéze (QF PCR) má své limity především v citlivějších analýzách, ve kterých je potřebné zachytit minoritní buněčnou linii a rozpoznat malé změny v závislosti na čase. V těchto případech může být chyba měření a reprodukovatelnost výsledků velmi ovlivněna hlavně lidským faktorem a efektivitou PCR. Hlavním cílem studie bylo posoudit a optimalizovat kvantitativní možnosti inovované QF PCR s přímou návazností na kvantifikaci Y sekvencí u gonozomálních mozaik. Metody a výsledky. Arteficiálně vytvořené Y/X DNA mozaiky byly testovány a kvantifikovány inovovanou QF PCR, která nahrazuje a rozšiřuje real-time PCR. Na základě porovnání intenzity fluorescence PCR produktů po jednotlivých cyklech byly sestrojeny grafy nárůstu fluorescence pro různá ředění. Analýzou podílu signálu vnitřní kontroly a příslušné mozaiky byla sestrojena kalibrační křivka pro kvantifikaci Y sekvencí. Pro výpočet vzácných mozaik byl sestaven empirický vzorec. Závěry. Rozšíření QF PCR o manuální real-time PCR eliminuje meze QF PCR a zpřesňuje kvantifikační analýzy založené na PCR. Novelizovaný DNA diagnostický přístup – IQF PCR, který se vyznačuje vysokou citlivostí a přesností, umožňuje významný posun v analýze gonozomálních Y/X mozaik.
Background. Quantification of fluorescence labelled PCR products on capillary electrophoresis (QF PCR) has limits primarily in the possibility of more sensitive analyses to detect minority cell lines and small time related variations. PCR efficiency and human factor affect measuring error and reproducibility of results in these cases. The aim of this work was to assess and optimise of innovated (I)QF PCR in quantification of Y sequences in gonosomal mosaics. Methods and Results. Artificially prepared Y/X mosaics were tested and quantified by IQF PCR, which replaces real-time PCR. Comparison of relative fluorescence to PCR cycles in different Y/X dilutions was plotted on the graphs. Calibration curve for Y sequences quantification was set by the analyses of ratio of Y/X fluorescent signals. An empirical formula was created for the rare mosaic calculation. Conclusions. QF PCR refined by manual real-time PCR eliminates limits of QF PCR and specifies quantitative analyses based on PCR. The outstanding feature of IQF PCR is its high sensitivity and accuracy in quantification of Y/X gonosomal mosaics.
313 s.
- Klíčová slova
- PCR,
- MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
Chronická myeloidní leukémie (CML) je charakterizována přítomností hybridního genu BCR-ABL, který vzniká v důsledku reciproké translokace t(9;22)(q34;q11) karyotypicky detekovatelné jako Ph chromozóm. Gen BCR-ABL kóduje hybridní protein s konstitutivně zvýšenou tyrozinkinázovou aktivitou, o kterém bylo prokázáno, že hraje zásadní roli v patogenezi onemocnění. Gen BCR-ABL je typickým znakem CML sloužícím k upřesnění diagnózy a sledování úspěšnosti léčby. Nejcitlivější metodou pro zjištění přítomnosti této aberace je reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) detekující transkript BCR-ABL, se schopností zjistit 1 leukemickou buňku mezi 105–106 normálních leukocytů. Pro sledování změn v hladině transkriptů BCR-ABL je využívána kvantitativní RT-PCR (Q-RT-PCR), která má vysoký prognostický význam. Nárůst a vysoká hladina transkriptu BCR-ABL jednoznačně signalizují špatnou odpověď na léčbu a špatnou prognózu, naproti tomu pokles a nízká hladina BCR-ABL dobrou odpověď na léčbu a dobrou prognózu. Pomocí Q-RT-PCR je možno zjistit změny stavu onemocnění o několik týdnů i měsíců dříve než ostatními metodami. V ÚHKT v Praze byla Q-RT-PCR zavedena v roce 1994 pro potřebu časného zjištění relapsu u pacientů po transplantaci kmenových buněk (TKB) a nyní je využívána pro monitorování úspěšnosti léčby všech pacientů s CML. Potvrdili jsme, že tato citlivá, přesná a neinvazivní vyšetřovací metoda má pro sledování stavu pacientů s CML zásadní význam.
Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by the presence of BCR-ABL fusion gene resulting from the reciprocal chromosome translocation t(9;22)(q34;q11), karyotypically detected as Ph chromosome. BCR-ABL gene was proved to play the principal role in CML pathogenesis. It is a hallmark of CML used in diagnostics and monitoring of the response to the therapy. The most sensitive method of detecting BCR-ABL aberration is RT-PCR which is able to find a single in leukemic cell betweey 106 normal leukocytes. Monitoring of BCR-ABL transcript level by quantitative RT-PCR is of the high prognostic value. High or increasing BCR-ABL transcript number signalizes bad response to treatment and a bad prognosis. On the contrary RT-PCR negativity, low level, or decreasing BCR-ABL transcript number denotes good response to treatment and good prognosis. Q-RT-PCR can detect changes in disease status several weeks or even months earlier than other methods. In 1994 the Q-RT-PCR was introduced at the Institute of Hematology and Blood Transfusion in Prague and was used for early detection of relapse after transplantation. At present it is used in all patients with CML for monitoring of response to the treatment. We have confirmed that this precise, sensitive and non-invasive method is of the principal importance for monitoring of disease status in CML patients.
- MeSH
- bcr-abl fúzní proteiny farmakokinetika genetika krev MeSH
- chronická myeloidní leukemie diagnóza genetika terapie MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- lidé MeSH
- methansulfonáty aplikace a dávkování MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí ekonomika metody statistika a číselné údaje MeSH
- přehledová literatura jako téma MeSH
- prognóza MeSH
- transplantace kmenových buněk MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
Folikulámí lymfomy (FL) jsou diagnostikovány na základě histologického obrazu a imunohistochemického profilu (CD20+, CD79álfa+, CD10+, BCL-2+, CD5-). U většiny nemocných s FL je prítomna translokace t(14;18)(q32;q21). Gen BCL2 (18q21) se dostává pod kontrolu regulačních oblastí genu IGH (14q32) a tím dochází ke zvýšené expresi proteinu BCL-2. Průkaz translokace lze využít pro následné monitorování nemocných (infiltrace kostní dřeně a perífemí krve nádorovými bunkami). Cílem studie bylo zavést na pracoviště metodu kvantitativní PCR (RQ-PCR, „realtime quantification") pro stanovení množství buněk nesoucích translokaci t(14;18) u nemocných s FL. Pro vyhledání translokace jsme použili metodu fluorescenční in situ hybrídizace na interfázických jádrech (I-FISH) v histologických řezech. Pomocí kvalitativní PCR jsme vybrali FL se zlomem genu BCL2 v hlavní zlomové oblasti (mbr). U nemocných s tímto znakem jsme pomocí RQ-PCR stanovovali relativní množství nádorových buněk nesoucích t(14;18). Množství buněk s touto translokaci v lymfatických uzlinách bylo podstatně vyšší než v kostní dřeni či v perífemí krvi. Metoda RQ-PCR, na rozdíl od kvalitativní PCR, umožňuje nejen konstatovat přítomnost nádorových buněk v periferní krvi a v kostní dřeni, ale jejím zásadním prínosem je určení množství nádorových buněk nesoucích t(14;18). Metoda RQ-PCR umožní sledovat aktivitu onemocnění (přechod do remise nebo vznik relapsu) a zjistit nástup dřeňového relapsu ještě před morfologicky prokazatelnou infiltrací kostní dřeně nebo perífemí krve.
Diagnosis of follicular lymphoma (FL) is based on histology and immunohistochemical profile (CD20+, CD79alfa+, CD10+, BCL-2+, CD5-). A chromosomal marker - translocation t(14;18)(q32;q21) supporting the tumor diagnosis and useful for monitoring bone marrow or peripheral blood infiltration by the tumor cells is also used. The BCL2 gene (18q21) is controlled by an enhancer of the IGH gene (14q32) resulting in BCL-2 protein overexpression. The translocation is present in the majority of patients with FL. The aim of the study was to introduce the quantitative PCR (RQ-PCR, real-time quantification) method for the assessment of the quantity of cells bearing the translocation t(14;18) in patients with FL. The fluorescence in situ hybrídization on interphasic nuclei (I-FISH) in histologic sections was used for screening of patients with the t(14;18). A search for the break of the BCL2 gene at the major breakpoint region (mbr) was performed by means of qualitative PCR. We determined the relative number of the tumor cells bearíng t(14;18) translocation (mbr) in patients with FL by the RQ-PCR. The relative quantity of these cells was significantly higher in the lymph nodes than in the bone marrow or peripheral blood. The RQ-PCR is a tool of choice to monitor the activity of the disease in individual patients, and to detect an early disease relapse before its manifestation at the level diagnosed by morphology.
Polymerasová řetězová reakce (PCR) je metoda používaná pro namnožení specifického úseku DNA. Pro své vlastnosti se stala tato technika oblíbenou a v praxi hojně používanou metodou. V současné době rozlišujeme tři generace PCR – tradiční PCR (I. generace), kvantitativní PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase – qPCR (II. generace) a digitální PCR – dPCR (III. generace). dPCR je robustní a citlivá metoda, díky čemuž nachází uplatnění v mnoha oblastech jako je mikrobiologie, analýza potravin, onkologie apod. Využívá se především pro absolutní kvantifikaci a/nebo detekci vzácných cílů. Její výhodou je, v porovnání s qPCR, přesnější kvantifikace nezávislá na počtu amplifikačních cyklů a kalibrační křivce.
Polymerase chain reaction (PCR) is a technique used to amplify a specific DNA segment. For its qualities, this technique has become popular and widely used method in practise. Nowaday, we distinguish three generations of PCR – traditional PCR (1st Generation), quantitative PCR with fluorescence detection – qPCR (2nd generation) and digital PCR – dPCR (3rd generation). dPCR is robust and sensitive method, which is applied in many fields such as microbiology, food analysis, oncology, etc. It is mainly used for absolute quantification and / or detection of rare targets. Its advantage, in comparison to qPCR, is more precise quantification independent of the number of amplification cycles and the calibration curve.
- Klíčová slova
- digitální PCR,
- MeSH
- DNA MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
- multiplexová polymerázová řetězová reakce metody MeSH
- polymerázová řetězová reakce klasifikace metody MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- techniky amplifikace nukleových kyselin MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Východisko. Molekulárně biologické metody založené na reverzní transkripci a následné polymerázové řetězové reakci (RT-PCR) jsou schopny detekovat přítomnost transkriptu BCR-ABL u chronické myeloidní leukémie (CML). V tomto sdělení prezentujeme naše zkušenosti se sledováním reziduální leukémie metodou real-time PCR s detekcí hybridizačními sondami u nemocných s CML léčených imatinibem a při sběru periferních krvetvorných buněk (PKB). Metody a výsledky. Stanovení hladin transkriptu BCR-ABL v periferní krvi bylo provedeno u 27 osob před nasazením a v průběhu léčby imatinibem mesylátem. Medián relativního množství BCR-ABL v periferní krvi před nasazením imatinibu byl 2,55 %. Množství transkriptu u 23 osob bez rezistence vůči imatinibu pokleslo během prvních šesti měsíců léčby na hodnotu 0,02 %. Po dvanáctiměsíční léčbě poklesl medián množství transkriptu na 0,005 %. V dalším průběhu léčby hladiny BCR-ABL kolísaly mezi hodnotami pod detekčním limitem metody (0,001 %) a 0,005 %. Tři pacienti byli vůči imatinibu primárně rezistentní s rozsahem hodnot od 0,13 % do 11,7 %. Jeden pacient vykazoval po 18 měsících léčby známky molekulárního relapsu. Z 16 pacientů po stimulaci PKB filgrastimem měly pouze dvě vyšetřované osoby hodnoty BCR-ABL v periferní krvi i v PKB pod detekčním limitem použité metody. U ostatních osob se koncentrace fúzního transkriptu pohybovala v koncentracích spolehlivě stanovitelných metodou RT-PCR. Závěry. Vzhledem k svému prognostickému významu je vyšetření BCR-ABL vhodné pro monitorování kinetiky reziduální choroby. Stanovení provedené v koncentrátu PKB jako potenciálním autotransplantátu může kompletovat informace o kvalitě těchto buněk z hlediska proporce BCR-ABL transkriptu a nastínit další možné terapeutické postupy a prognózu pacienta.
Background. Molecular biology methods based on reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) are able to detect the presence of BCR-ABL transcripts in chronic myeloid leukemia (CML). In this study we present our experience with monitoring of residual disease using real-time PCR with hybridization probes detection in patients treated with imatinib mesylate and in collected peripheral blood progenitor cells (PBPC). Methods and Results.We measured the level of BCR-ABL transcripts in peripheral blood cells of 27 subjects before and in the course of the imatinib treatment. The median of relative quantity of BCR-ABL in the blood before imatinib therapy was 2.55%. The number of the transcripts in 23 imatinib-sensitive subjects decreased to 0.02% in 6 months. After 12 months of the treatment the BCR-ABL median was 0.005%. Subsequent levels fluctuated between values below the detection limit (DL, 0.001%) and 0.005%. Three patients were primarily resistant to imatinib with the BCR-ABL range of 0.13%-11,7% during the treatment. One subject showed marks of molecular relapse after 18 months of the treatment. Only two of 16 filgrastim-stimulated patients had BCR-ABL levels in the blood and in collected PBPC below DL. In other subjects BCR-ABL transcripts were determined within the measurable range of RT-PCR. Conclusions. Taking into account prognostic importance, the measurement of BCR-ABL transcripts is an effective approach to monitoring of residual CML kinetics. Evaluation of BCR-ABL levels in collected PBPC can complete information on quality of the cells in potential autotransplants, and choose subsequent therapeutic protocols and patient prognosis.
- MeSH
- bcr-abl fúzní proteiny krev MeSH
- chemorezistence MeSH
- chronická myeloidní leukemie diagnóza farmakoterapie genetika MeSH
- faktor stimulující kolonie granulocytů aplikace a dávkování MeSH
- imatinib mesylát MeSH
- lidé MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody MeSH
- prognóza MeSH
- protinádorové látky aplikace a dávkování farmakologie MeSH
- reziduální nádor diagnóza farmakoterapie genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
Východisko. Z vysoce citlivých molekulárně biologických metodik využívaných při monitorování léčby hemato-onkologických pacientů mohou být proto pro klinická využití přínosnější a jsou žádanější metodiky kvantifikující umožňující predikci i odhad odpovědi na léčbu. Mnohdy, spíše než absolutní kvantifikace, může být informativní i relativní výsledek metodik využívajících stanovení konečného množství amplifikačních produktů, např. komparativní polymerázové řetězové reakce (PCR). Metody a výsledky. Naše provedení komparativní PCR využívá optimalizované duplexní koamplifikace specifické sekvence, kterou je bud' klonální restrukturace genu pro těžký imunoglobulinový řetězec CDR3 nebo sekvence úseku interchromozomální translokace t(14;18) - bc12/Jh a vnitřního standardu, úseku genu Hras 1 (ras). Tyto koamplifikace jsou prováděny s dlouhodobě uchovávanými vzorky DNA z kostních dření a periferní krve paralelně v jediném běhu PCR a poté jsou gelovou denzitometrií kvantifikovány poměry produktů této duplexní reakce v její exponenciální fázi. Metodika byla využita v průběhu několika měsíců až několika let při monitorování nemocných nehodgkinským maligním lymfomem (NHL) léčených konvenční terapií, vysokodávkovou terapií s následnou transplantací kmenovými buňkami nebo terapií monoklonální protilátkou anti CD20 (Rituximab). Při 50 kvantitativních molekulárních analýzách, které byly doplněny klinickými údaji až dodatečně, byl zjištěn souhlas s konstatováními klinickými ve všech případech klesajícího nebo stoupajícího množství markerů, u některých pacientů, u nichž bylo dosaženo PCR negativity, došlo později opět k PCR pozitivitě. Výsledky zjištěné v kostní dřeni se shodovaly s výsledky z periferní krve. Výsledky dosažené pomocí komparativní PCR se shodovaly s výsledky zjištěnými užitím PCR v reálném čase. Závěry. Komparativní PCR je využitelná při monitorování účinnosti léčby. Možnost prediktivních závěrů na základě těchto výsledků závisí na frekvenci odběrů vzorků a na stupni citlivosti detekce, který by měl být nezbytně stanoven u negativních případů.
Background. PCR techniques detecting interchromosomal translocation and clonal immunoglobulin gene rearrangement (IgH) as disease markers in non-Hodgkin's lymphomas (NHL) has been utilised past ten years. However, qualitative PCR detection of persisted minimal residual disease cannot provide clinically useful prognostic information and presently, quantitative approaches are required to predict patient outcome and assess response to the treatment. In some cases, „end-point" quantifying techniques, such as comparative PCR, are applicable and the relative estimation of differences in target quantity may serve in disease monitoring rather than absolute number of target copies. Methods and Results. Our method of comparative PCR employs co-amplification of sequences of interest (clonal CDR3, bc12/Jh) and the segment of Hras 1 gene(ras) as an internal standard. Serial dilutions of stored diagnostic DNAs from blond and bone marrow are examined in the same PCR and, after gel densitometry, the amount of initial target is assessed by comparing exponential products of co-amplification. The comparative PCR assay was utilized in monitoring of NHL patients cured either with conventional therapy, or with high-dose regimens and transplantation with stem cells, or with chimaeric anti-CD20 monoclonal antibody (Rituximab). Results from 50 monitored intervale obtained during several months up to several years were supplemented with clinical statements retrospectively. Some of patients became PCR-negative, reappearance of PCR-pozitivity was observed as well. The decrease or increase of disease marker corresponded to clinical observations. Results obtained from bone marrow were in agreement with those obtained from blond. Conclusions. End-point quantifying PCR comparative assay may provide an information on the increased risk of relapse and impact of the therapy. The predictive value of these methods depends on the frequency of sample taking and on the sensitivity of the method, which should be monitored in negative cases.
