Přestože PCR detekce mykotických patogenů v klinických vzorcích se na stránkách odborných časopisů objevuje již více než dvacet let, je použití této metody pro rutinní diagnostiku invazivní aspergilózy stále diskutabilní. A to i přesto, že metody molekulární biologie již našly své stálé místo v mnoha odvětvích moderní mikrobiologie. Genotypizace bakteriálních kmenů rezistentních na antibiotika, molekulární epidemiologie, ale i rutinní detekce, např. virových infekcí z nejrůznějších klinických materiálů je v dnešní době zcela běžnou praxí. Ve všech těchto oblastech znamenalo zavedení metody PCR diagnostiky zrychlení, zfpřesnění a zjednodušení celého procesu. Tento přehledový článek má za cíl ukázat, v čem je detekce původců mykotických infekcí jiná a proč se ji dosud nepodařilo zavést do rutinní praxe.
PCR detection of fungal pathogens in clinical samples has been discussed in journals for more than two decades. However, its use for diagnosing invasive aspergillosis is still controversial, despite the fact that molecular methods are routinely used in various fields of modern microbiology. These are e. g. genotyping of bacterial strains resistant to antibiotics, molecular epidemiology or routine detection of viral infections in clinical material. PCR methods have made the diagnostic apphcations faster, simpler and more accurate. This review deals with issues related to molecular methods for diagnosing invasive fungal infections and the main factors limiting their use in everyday clinical practice.
Východisko. Kvantifikace fluorescenčně značených PCR produktů na kapilární elektroforéze (QF PCR) má své limity především v citlivějších analýzách, ve kterých je potřebné zachytit minoritní buněčnou linii a rozpoznat malé změny v závislosti na čase. V těchto případech může být chyba měření a reprodukovatelnost výsledků velmi ovlivněna hlavně lidským faktorem a efektivitou PCR. Hlavním cílem studie bylo posoudit a optimalizovat kvantitativní možnosti inovované QF PCR s přímou návazností na kvantifikaci Y sekvencí u gonozomálních mozaik. Metody a výsledky. Arteficiálně vytvořené Y/X DNA mozaiky byly testovány a kvantifikovány inovovanou QF PCR, která nahrazuje a rozšiřuje real-time PCR. Na základě porovnání intenzity fluorescence PCR produktů po jednotlivých cyklech byly sestrojeny grafy nárůstu fluorescence pro různá ředění. Analýzou podílu signálu vnitřní kontroly a příslušné mozaiky byla sestrojena kalibrační křivka pro kvantifikaci Y sekvencí. Pro výpočet vzácných mozaik byl sestaven empirický vzorec. Závěry. Rozšíření QF PCR o manuální real-time PCR eliminuje meze QF PCR a zpřesňuje kvantifikační analýzy založené na PCR. Novelizovaný DNA diagnostický přístup – IQF PCR, který se vyznačuje vysokou citlivostí a přesností, umožňuje významný posun v analýze gonozomálních Y/X mozaik.
Background. Quantification of fluorescence labelled PCR products on capillary electrophoresis (QF PCR) has limits primarily in the possibility of more sensitive analyses to detect minority cell lines and small time related variations. PCR efficiency and human factor affect measuring error and reproducibility of results in these cases. The aim of this work was to assess and optimise of innovated (I)QF PCR in quantification of Y sequences in gonosomal mosaics. Methods and Results. Artificially prepared Y/X mosaics were tested and quantified by IQF PCR, which replaces real-time PCR. Comparison of relative fluorescence to PCR cycles in different Y/X dilutions was plotted on the graphs. Calibration curve for Y sequences quantification was set by the analyses of ratio of Y/X fluorescent signals. An empirical formula was created for the rare mosaic calculation. Conclusions. QF PCR refined by manual real-time PCR eliminates limits of QF PCR and specifies quantitative analyses based on PCR. The outstanding feature of IQF PCR is its high sensitivity and accuracy in quantification of Y/X gonosomal mosaics.
Pro zrychlení identifikace mykobakteriálních druhů z urychlené kultivace byla zavedeny a optimalizovány molekulárně biologické metody - PCR/RFLP (polymerázová řetězová reakce s následnou restrikční analýzou naamplifikovaného produktu). Pro tyto metody využíváme amplifikaci konzervativních oblastí dna J genu a HSP 65 kDa genu mykobakteriálního genomu. V období od května 1999 do června 2001 bylo identifikováno 144 kmenů klasickými metodami a zároveň metodou PCR/RFLP. Zavedením metody PCR/RFLP byla doba identifikace zkrácena z původních 3 týdnů na 2-7 dní.
A rapid procedure for the identification of cultured Mycobacterium isolates, based on the combination of enzymatic amplificauon and restnction analysis (PCR/RFLP), was optimalized and Qy the polvmerase chain reaction (PCR) is amplified part of dna J gene res. HSP 65 kDA gene common to all mycobacteria. 144 mycobacterial strains were identified parallel by conventional bacteriological determination and by PCR/RFLP from May 1999 to June 2001. Differentiation of Mycobacteria using PCR/RFLP methods can be completed within 2-7 days.
Cíl: Cílem retrospektivní studie bylo sumarizovat a zhodnotit výsledky pacientů s podezřením na infekci rodem Chlamydia vyšetřených pomocí „in house“ metody nested PCR (polymerázová řetězová reakce). Studie pracuje s daty získanými vyšetřením pacientů v letech 2001-2003 z regionu východních Čech na Oddělení molekulární biologie společného pracoviště Ústavu klinické mikrobiologie (ÚKM) a Ústavu klinické biochemie a diagnostiky (ÚKBD). Materiál a metodika: V roce 2001 bylo provedeno 291 vyšetření, v roce 2002 to bylo již 562 a v roce 2003 dokonce 760 vyšetření. Celkem bylo za toto období přijato 1 613 vzorků k vyšetření, z nichž jich bylo 1 587 vyšetřeno (26 nepoužitelných vzorků). Více jak 70 % všech vyšetření se provádělo ze tří druhů materiálu: moči (41,8 % všech vyšetřených vzorků), BALu (bronchoalveolární laváž; 15,3 % všech vyšetřených vzorků) a plné krve (14,9 % všech vyšetřených vzorků). Vyšetření bylo provedeno pomocí „in house“ metody nested PCR využívající primery z oblasti MOMP (ompA) genu Chlamydia spp. Výsledky: Celková pozitivita činila 5,67 %, 1,26 % vzorků bylo vyhodnoceno jako nejasný výsledek a 93,07 % vyšetřovaných vzorků bylo negativních. U mužů byla zachycena PCR pozitivita u 6,11 % a u žen toto číslo činilo 5,35 %. Nejvíce pozitivních vzorků pocházelo z věkových skupin 70-791etých (11,67 %), 10-191etých (6,51 %) a 40-491etých (6,45 %). Celková pozitivita u stěrů z urogenitálního systému byla 6,48 %, z moči 3,92 %, BALu 10,70 % a plné krve 5,51 %.
Purpose of the study. The study was intended to summarize and evaluate the results in patients with a suspected infection by the genus Chiamydia, investigated with an „in-house" method of nested PCR (polymerase chain reaction). The study worked with data from patients living in eastern Bohemia, who were examined in the years 2001-2003 at the Dept. of Molecular Biology a research laboratory shared by the Institute of Clinical Microbiology and the Institute of Clinical Biochemistry and Diagnostics. Material and methods: 291 explorations were done in 2001, in 2002 already 562 and in 2003 their figure reached 760. The total number of samples received for investigation during that period was I 613. 1 587 were actually investigated, 26 were unsuitable and could not be used. More than 70 % of all investigations were done with three types of material: urine (41.8 % of all the investigated samples), BAL (15.3 % of all the investigated samples) and whole blood (14.9 % of all the investigated samples). The investigations were carried out with the „in-house" nested PCR method, which uses primers from the MOMP(ompA) area of the genus Chlamydia spp. Results: Total positivity was 5.67 %, in 1.26 % of the samples the resulted was considered uncertain and 93.07 % of the investigated sampies were negative. In men PCR positivity was 6.11 %, in women 5.35 %. The major proportion of positive samples was from the age groups 70-79 years (11.67 %), 10-19 years (6.51 %) and 40-49 years (6.45 %). Overall positivity in smears from the urogenital system was 6.48 %, from urine 3.92 %, from BAL 10.70 % and from whole blood 5.51 %.
- MeSH
- diagnostické techniky molekulární metody MeSH
- hodnocení výsledků zdravotní péče MeSH
- infekce bakteriemi čeledi Chlamydiaceae diagnóza patologie MeSH
- lidé MeSH
- molekulární biologie metody MeSH
- pohlavní dimorfismus MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
- populační charakteristiky MeSH
- retrospektivní studie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
Cíl práce: Zavedení další bezkultivační metody invazivního meningokokového onemocnění, polymerase chain reaction (PCR), která obohatí současně užívané bezkultivační metody a zvýší procento laboratorně potvrzených onemocnění. Materiál a metody: Metoda PCR byla optimalizována na kmenech Neisseria meningitidis B a C. Senzitivita a specificita PCR detekce Neissera meningitidis B a C z klinického materiálu byla hodnocena na 195 vzorcích likvoru od pacientů s invazivním meningokokovým onemocněním (80 vzorku likvoru), non-meningokokovou bakteriálni meningitidou (49 vzorku likvoru) a virovou meningitidou (66 vzorků likvoru). Výsledky: Pro PCR detekci Neisseria meningitidis B a C z likvoru byly zjištěny následující parametry, senzitivita = 0,85, specificita = 0,95, pozitivní předpovědní hodnota = 0,88 a negativní předpovědní hodnota = 0,93. Metoda PCR posada laboratorní potvrzení etiologie u 47,4 % z 19 vyšetřených likvoru u pravděpodobných invazivních meningokokových onemocnění, jejichž meningokoková etiologie nebyla potvrzena klasickými metodami. V současné době je zaváděna semi-nested PCR strategie k detekci Neisseria meningitidis z likvoru, krve a séra, jakož i rozšířená PCR metoda pro detekci Haemophilus influenzae b a Streptococcus pneumoniae z likvoru, krve a séra. Závěr: V Národní referenční laboratoři pro meningokokové nákazy SZÚ Praha byla zavedena PCR metoda detekce Neisseria meningitidis B a C z likvoru a je nabízena k rutinnímu použití.
Objectives: To introdukce a further non-culture method for diagnosis of invasive meningococcal dinase, polymerase chain reaction (PCR), in addition to those currently used to increase the percentage of laboratory confirmed cases. Materials and methods: The PCR method was optimist on Neisseria meningitidis B and C strains. Sensitivity and specificity of PCR detection of Neisseria meningitidis B and C from clinical material was assessed in 195 samples of the cerebrospinal fluid obtained from patiens with invasive meningococcal dinase (80 CSF samples), non-meningococcal bacterial meningitis (49 CSF samples) and viral meningitis (66 CSF samples). Results: The following parameters of the PCR method for detection of Neisseria meningitidis B and C from the CSF were found: sensitivity = 0.85, specificity = 0.95, positive predictive value = 0.88 and negative predictive value = 0.93. PCR gave laboratory confirmation in 47.4 % of 19 CSF samples from patiens with suspected invasive meningococcal dinase, whose meningococcal infection was not confirmed by classical methods. The semi-nested PCR strategy and an extended PCR method for detection of Haemophilus influenzae h and Streptococcus pneumoniae from CSF, blood and serum has been introduced recently in our laboratory. Conclusions: The PCR method for detection of Neisseria meningitidis B and C from the cerebrospinal fluid was introduced in the National Reference Laboratory for Meningococcal Infections in NIPH, Prague and is propřed for routine use.
Polymerasová řetězová reakce (PCR) je metoda používaná pro namnožení specifického úseku DNA. Pro své vlastnosti se stala tato technika oblíbenou a v praxi hojně používanou metodou. V současné době rozlišujeme tři generace PCR – tradiční PCR (I. generace), kvantitativní PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase – qPCR (II. generace) a digitální PCR – dPCR (III. generace). dPCR je robustní a citlivá metoda, díky čemuž nachází uplatnění v mnoha oblastech jako je mikrobiologie, analýza potravin, onkologie apod. Využívá se především pro absolutní kvantifikaci a/nebo detekci vzácných cílů. Její výhodou je, v porovnání s qPCR, přesnější kvantifikace nezávislá na počtu amplifikačních cyklů a kalibrační křivce.
Polymerase chain reaction (PCR) is a technique used to amplify a specific DNA segment. For its qualities, this technique has become popular and widely used method in practise. Nowaday, we distinguish three generations of PCR – traditional PCR (1st Generation), quantitative PCR with fluorescence detection – qPCR (2nd generation) and digital PCR – dPCR (3rd generation). dPCR is robust and sensitive method, which is applied in many fields such as microbiology, food analysis, oncology, etc. It is mainly used for absolute quantification and / or detection of rare targets. Its advantage, in comparison to qPCR, is more precise quantification independent of the number of amplification cycles and the calibration curve.
- Klíčová slova
- digitální PCR,
- MeSH
- DNA MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
- multiplexová polymerázová řetězová reakce metody MeSH
- polymerázová řetězová reakce klasifikace metody MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- techniky amplifikace nukleových kyselin MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Cíl práce: Vyvinutí rozšířené polymerázové řetězové reakce (PCR), která umožňuje bezkultivační diagnostiku meningokokové, homofilové a pneumokokové etiologie u závažných onemocnění. Materiál a metody: Metoda PCR byla optimalizována na kmenech Nesseria meningitidis, HaemophiJus influenzae b a Streptococcus pneumoniae. Detekce patogenů z klinického materiálu byla hodnocena na 230 vzorcích od pacientů se závažným onemocněním. Výsledky: Z celkového množství 230 vzorků byly u 103 vzorků (44,7 %) zjištěny pozitivní výsledky PCK. U likvoru bylo procento pozitivity vyšší (57,0 %) než procento pozitivity séra (33,8 %) či krve (33,3 %). Závěr. Metodou PCR lze prokázat bakteriální deoxyribonukleovou kyselinu v klinickém materiálu i po zahájení léčby antibiotiky. Výsledky PCR jsou k dispozici dříve než výsledky kultivace. PCR metoda ve spojení s multilokusovou sekvenční typizací (MLST) umožňuje klonální analýzu etiologických agens i v případě, že nebyla získána kultivací.
Objectives: Development of extended polymerase chain reaction (PCR) for non-culture detection of Nesseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumonie from invasive infections. Materials and methods: A method of PCR was optimalised on strains of Nesseria meningitidis, Haemophilus influenzae b and Streptococcus pneumonic. Detection of pathogens was evaluated on 230 samples from patiens with invasive infection. Results: Positive results of PCR were found in 103 samples of 230 (44.7 %). The percentage of positivity was higher in CSF samples (57.0 %) than in serum (33.8 %) or blood (33.3 %) samples. Conclusion: PCR method enables etiological diagnostics in cases, where antibiotic treatment was started. PCR results are available earlier than the results of cultivation. Multilocus sequence typing (MLST) of PCR products enables clonal analysis of etiological agents even in cases with negative results of cultivation.
- MeSH
- bakteriální infekce diagnóza epidemiologie MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- Haemophilus influenzae typu B patogenita MeSH
- lidé MeSH
- meningitida bakteriální diagnóza MeSH
- mikrobiologické techniky metody MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
- Streptococcus pneumoniae patogenita MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Geografické názvy
- Česká republika MeSH
Update Series
300s : il.
- Klíčová slova
- PCR,
- MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
- Konspekt
- Biochemie. Molekulární biologie. Biofyzika
- NLK Obory
- biologie
- biochemie
- biomedicínské inženýrství
313 s.
- Klíčová slova
- PCR,
- MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
