Cílem práce bylo porovnání dosažených výsledků molekulárních metod využívaných v Oddělení bakteriálních vzdušných nákaz (OBVN) CEM SZÚ pro účely detekce, identifikace a typizace bakterií Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae a Haemophilus influenzae v klinických (kultivačně negativních) vzorcích při podezření na uvedená invazivní bakteriální onemocnění. OBVN nabízí využití molekulární diagnostiky uvedených bakteriálních původců menigitid a sepsí z klinických vzorků již řadu let. Spektrum metod se však změnilo. Z původní polymerázové řetězové reakce s elektroforetickým vyhodnocením (seminested PCR) k real-time polymerázové řetězové reakci (rt-PCR). Bylo provedeno souběžné srovnání obou metodik na 56 klinických vzorcích, které ukazuje lepší výsledky rt-PCR oproti seminested PCR.

The aim was to compare the outcomes of molecular methods used in the Unit for Airborne Bacterial Infections (UABI) for the detection, identification, and typing of the bacteria Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae from clinical culture-negative specimens of patients with suspected invasive bacterial infection. The UABI has been providing molecular diagnosis of the above-mentioned bacterial pathogens from clinical specimens of patients with meningitis or sepsis for years. However, the range of the methods used has changed: the UABI switched from the polymerase chain reaction (PCR) with reading of the results by elecrophoresis (seminested PCR) to the real-time polymerase chain reaction (rt-PCR). The outcomes of the two methods were compared using 56 clinical specimens, with rt-PCR proving superior to seminested PCR

• Klíčová slova
• seminested PCR, rt-PCR,
• MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• Haemophilus influenzae izolace a purifikace   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce statistika a číselné údaje   MeSH
• Neisseria meningitidis izolace a purifikace   MeSH
• polymerázová řetězová reakce * metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• Streptococcus pneumoniae izolace a purifikace   MeSH
• techniky typizace bakterií metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• Publikační typ
• srovnávací studie MeSH

Cíl práce: Vyvinutí rozšířené polymerázové řetězové reakce (PCR), která umožňuje bezkultivační diagnostiku meningokokové, homofilové a pneumokokové etiologie u závažných onemocnění. Materiál a metody: Metoda PCR byla optimalizována na kmenech Nesseria meningitidis, HaemophiJus influenzae b a Streptococcus pneumoniae. Detekce patogenů z klinického materiálu byla hodnocena na 230 vzorcích od pacientů se závažným onemocněním. Výsledky: Z celkového množství 230 vzorků byly u 103 vzorků (44,7 %) zjištěny pozitivní výsledky PCK. U likvoru bylo procento pozitivity vyšší (57,0 %) než procento pozitivity séra (33,8 %) či krve (33,3 %). Závěr. Metodou PCR lze prokázat bakteriální deoxyribonukleovou kyselinu v klinickém materiálu i po zahájení léčby antibiotiky. Výsledky PCR jsou k dispozici dříve než výsledky kultivace. PCR metoda ve spojení s multilokusovou sekvenční typizací (MLST) umožňuje klonální analýzu etiologických agens i v případě, že nebyla získána kultivací.

Objectives: Development of extended polymerase chain reaction (PCR) for non-culture detection of Nesseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumonie from invasive infections. Materials and methods: A method of PCR was optimalised on strains of Nesseria meningitidis, Haemophilus influenzae b and Streptococcus pneumonic. Detection of pathogens was evaluated on 230 samples from patiens with invasive infection. Results: Positive results of PCR were found in 103 samples of 230 (44.7 %). The percentage of positivity was higher in CSF samples (57.0 %) than in serum (33.8 %) or blood (33.3 %) samples. Conclusion: PCR method enables etiological diagnostics in cases, where antibiotic treatment was started. PCR results are available earlier than the results of cultivation. Multilocus sequence typing (MLST) of PCR products enables clonal analysis of etiological agents even in cases with negative results of cultivation.

• MeSH
• bakteriální infekce diagnóza   epidemiologie   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• Haemophilus influenzae typu B patogenita   MeSH
• lidé MeSH
• meningitida bakteriální diagnóza   MeSH
• mikrobiologické techniky metody   MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• Streptococcus pneumoniae patogenita   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

Bakterie Haemophilus influenzae se vyskytuje v opouzdřených či neopouzdřených variantách. Na podkladě kap-sulárního antigenu lze rozlišit 6 typů a-f, neopouzdřené kmeny se označují jako netypovatelné NT. K typizaci lzekromě již zavedených klasických a molekulárních metod využít i nově zavedenou molekulární metodu rt-PCR.

The bacterium Haemophilus influenza is found in both capsulated and non-capsulated variants. Based on thecapsular antigen, six types, a-f, can be differentiated, and non-capsulated strains are referred to as non-typeable,NT. Apart from the conventional and molecular typing methods, a newly implemented molecular method, rt-PCR,can also be used for typing.

• MeSH
• Haemophilus influenzae genetika   MeSH
• hemofilové infekce * diagnóza   epidemiologie   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí * metody   trendy   MeSH
• techniky typizace bakterií metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

Rychlá a včasná PCR detekce zejména hemotogenně diseminovaných kandidóz u imunodeficitních pacientů, testování citlivosti k antimykotikům, molekulárně-genetická typizace (RAPD a PFGE) a korelace výsledků typizace s klinickými a epidemiologickými údaji.; Early and fast PCR detection of yeast bloodstream infections in immunocompromised patients particularly, antifungal susceptibility testing, molecular typing (RAPD, PFGE) and correlation of typing results with characteristics significant therapy.

• MeSH
• DNA fungální MeSH
• infekce spojené se zdravotní péčí diagnóza   MeSH
• kandidóza diagnóza   MeSH
• oportunní infekce diagnóza   MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• infekční lékařství
• biochemie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

Zavedli jsme metodu detekce chromozomální DNA Treponema pallidum subsp. pallidum dvoukrokovou (nested) PCR reakcí, která amplifikuje část genu TP0319, kódujícího hypotetický membránový lipoprotein (gen tmpC). Vyšetřili jsme 138 sér od 111 dospělých pacientů v primárním, sekundárním, časně latentním a pozdně latentním stadiu a také pacientů s podezřením na syfilis. Chromozomální DNA T. p. pallidum se v séru dospělých pacientů nepodařilo detegovat. Při vyšetření 11 kožních a slizničních stěrů (7 genitálních, 4 faryngeálních) jsme nalezli 6 pozitivních od 3 pacientů ve stadiu primární a sekundární syfilis. Pozitivní byl rovněž jeden stěr pacienta s časnou kongenitální syfilis. Sekvenování DNA genů TP0136 a TP0548 z pozitivních vzorků prokázalo výskyt dvou kmenů sekvenčně identických s kmenem T. p. pallidum SS14 a dvou unikátních syfilitických kmenů, doposud u T. p. pallidum nepopsaných. U jednoho vyšetřovaného novorozence s pozitivním výsledkem vyšetření kožního vzorku jsme prokázali treponemální DNA také v séru a v cerebrospinálním moku. Pokroky v molekulární typizaci T. p. pallidum v klinickém materiálu přispějí k rozvoji epidemiologie syfilis a přinesou možnosti rozlišení mezi reinfekcí a reaktivací syfilitického procesu.

An in-house two-step nested PCR amplification targeting the tmpC gene (TP0319, encoding putative membrane lipoprotein) was used for detection of chromosomal DNA of Treponema pallidum subsp. pallidum in clinical specimens.We tested 138 blood serum samples from 111 adult patients with suspected, primary, secondary, early or late latent syphilis. T. p. pallidum DNA was not detected in any of the analyzed specimens. Out of 11 mucocutaneous swabs (7 genital and 4 pharyngeal), 6 collected from 3 patients with primary or secondary syphilis tested positive. One skin swab from a patient with early congenital syphilis was also positive as were his serum and cerebrospinal fluid samples. DNA sequencing of the genes TP0136 and TP0548 from the positive samples revealed two strains with DNA sequences identical to that of T. p. pallidum strain SS14 and two unique previously undescribed T. p. pallidum strains. The advances in molecular typing of T. p. pallidum in clinical specimens will be of relevance to the epidemiology of syphilis and will allow for clinical discrimination between reinfection and syphilitic reactivation.

• MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   statistika a číselné údaje   využití   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• lidé MeSH
• odběr biologického vzorku klasifikace   metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• polymerázová řetězová reakce klasifikace   metody   statistika a číselné údaje   MeSH
• sekvence nukleotidů účinky léků   MeSH
• techniky typizace bakterií metody   statistika a číselné údaje   využití   MeSH
• Treponema pallidum genetika   izolace a purifikace   klasifikace   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• srovnávací studie MeSH

Cíl práce: Zavedení nové molekulární PCR metodiky pro účely typování kmenů Streptococcus pneumoniae v NRL pro streptokokové nákazy. Materiál a metodika: Kmeny Streptococcus pneumoniae jsou zasílány do NRL z různých regionů České republiky. Běžně je identifikace a typizace založena na morfologii kmene, citlivosti k optochinu, rozpustnosti ve žluči, latexaglutinaci a Quellung reakci. Od roku 2012 byla použita nová multiplexová polymerázová řetězová reakce (mPCR). Proběhlo testování nové metody na 210 izolátech S. pneumoniae a na 8 izolátech příbuzných druhů S. pseudopneumoniae, S. sanguinis a S. oralis. Výsledky: Nová mPCR metoda byla v NRL pro streptokokové nákazy aplikována do algoritmu identifikace a především typizace S. pneumoniae. Technika mPCR umožnila správně identifikovat a otypovat všechny kmeny pneumokoků zkoumaného souboru, naopak izoláty příbuzných druhů vykazovaly správnou negativní reakci. Metoda mPCR měla ve zkoumaném souboru 100% senzitivitu i specificitu. Ukázalo se, že PCR reakce je pro typování S. pneumoniae výborně použitelná metoda. Závěr: Sérotypy a séroskupiny S. pneumoniae byly doposud rozlišovány pouze pomocí sérologické Quellung reakce, nyní došlo ke změně a novému zavedení ­mPCR reakce. Jedná se o molekulární metodu zlepšující a zpřesňující typizaci S. pneumoniae.

Study aim: To introduce a novel molecular PCR method for the typing of Streptococcus pneumonia in the National Reference Laboratory (NRL) for Streptococcal Infections. Material and Methods: Strains of Streptococcus pneumoniae are referred to the NRL from different regions of the Czech Republic. Generally, the identification and typing are based on strain morphology, optochin susceptibility, bile solubility, latex agglutination, and the Quellung reaction. Since 2012, a novel multiplex polymerase chain reaction (mPCR) assay has been introduced. The novel assay was tested on 210 S. pneumoniae isolates and 8 isolates of the related species S. pseudopneumoniae, S. sanguinis, and S. oralis. Results: The NRL for Streptococcal Infections has included a novel mPCR assay in the algorithm of S. pneumoniae identification and typing. The mPCR assay was able to identify and type any pneumococcal strain from the study collection, with the isolates of the related species remaining negative. The mPCR assay showed 100% sensitivity and specificity in this study. The pCR appeared to be an excellent tool for S. pneumoniae typing. Conclusion: Until recently, S. pneumoniae serotypes and serogroups were differentiated using a serological approach (Quellung reaction), but the NRL for Streptococcal Infections has switched to a novel mPCR assay. This molecular tool improves S. pneumoniae typing, making it more accurate.

• Klíčová slova
• PCR typování, Quellung reakce,
• MeSH
• algoritmy MeSH
• lidé MeSH
• molekulární typizace MeSH
• multiplexová polymerázová řetězová reakce * metody   statistika a číselné údaje   využití   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• sérotypizace MeSH
• Streptococcus pneumoniae * genetika   klasifikace   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• hodnotící studie MeSH

Celogenomová sekvenace několika kmenů Treponema pallidum (TP, t.j. kmenů Nichols, SS14, Mexico A a DAL-1) umožnila vývoj vysoce specifické PCR diagnostiky TP. PCR detekce treponemální DNA umožňuje identifikovat kmenově specifické genomové sekvence a takégeneticky vyšetřovat citlivost na některá antibiotika. Cílem projektu je sběr klinických vzorků z ČR a to zejména anogenitálních stěrů a vzorků plné krve. Z těchto vzorků budeme izolovat treponemální DNA, kterou budeme po amplifikaci sekvenovat (ve variabilních chromosomálních lokusech). Navíc budeme molekulárně biologicky určovat rezistenci k makrolidovým antibiotikům a klindamycinu. Sekvence získané z různých izolátů TP budou srovnány a profil jednonukleotidových záměn, delecí a inzercí bude využit pro shlukovací analýzu treponemálních izolátů a pro epidemiologické účely. Dále budeme vyvíjet rychlejší a levnější diagnostické testy pro molekulární typizaci původce syfilis.; Whole genome sequencing of several strains of Treponema pallidum (TP, i.e. strains Nichols, SS14, Mexico A and DAL-1) allowed development of highly specific PCR diagnostics that enabled typing of TP by sequencing of variable genomic loci. Moreover, the obtained TP DNA from patients will be also tested on the presence of macrolide resistance-causing mutations in the TP genome. The proposal plans to collect TP samples (mainly genitoanal swabs and whole blood samples) from several regions of Czech Republic. The DNA extracted from clinical samples will be amplified and sequenced in several chromosomal loci including TP0136 and TP0548 genes and in the macrolide resistance locus. The obtained sequences will be analyzed and clustered and confronted with the epidemiological data. In addition, development of fast, reliable and cheap diagnostic tests for molecular typing of syphilis-causing treponemes is planned.

• MeSH
• bakteriální léková rezistence MeSH
• makrolidy MeSH
• molekulární typizace MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• syfilis epidemiologie   MeSH
• techniky typizace bakterií MeSH
• Treponema pallidum MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• epidemiologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR

Jsou prezentovány první výsledky charakterizace kmenů Haemophilus influenzae novou metodoumultilokusové sekvenační typizace (MLST). Charakterizace souboru 28 kmenů H. influenzae izolovanýchz invazivních onemocnění v České republice ukázala klonální homogenitu těchto kmenů:z 26 testovaných kmenů H. influenzae b vykazovalo 22 kmenů jednotný sekvenční typ: ST-6. U 4kmenů byly zjištěny námi nově popsané sekvenční typy: ST-83 (3 kmeny) a ST-84 (1 kmen). U 2netypovatelných kmenů H. influenzae byly zjištěny jiné sekvenční typy než ST-6: ST-3 a námi nověpopsaný ST-85. První výsledky MLST ukazují, že ST-6 je typický pro H. influenzae b izolovanéz invazivních onemocnění v České republice. Námi nově popsané sekvenční typy ST-83, ST-84 a ST-85byly registrovány v celosvětové databázi MLST H. influenzae (http://haemophilus.mlst.net).

First results of multilocus sequence typing (MLST) of Haemophilus influenzae strains are presented.MLST of 28 H. influenzae strains isolated frompatients with invasive diseases in the Czech Republicis indicative of clonal homogeneity of these strains: 22 out of 26 H. influenzae b strains tested wereof the same sequence type, ST-6. Four strains were of two sequence types newly described in thisstudy: ST-83 (3 strains) and ST-84 (1 strain). Two nontypeable H. influenzae strains were assigned tosequence types other than ST-6: ST-3 and ST-85 newly described in this study. First MLST resultsshow ST-6 to be typical of H. influenzae b isolated from patients with invasive diseases in the CzechRepublic. The sequence types newly described in this study, i.e. ST-83, ST-84 and ST-85, weresubmitted to the worldwide H. influenzae MLST database (http://haemophilus.mlst.net).

• MeSH
• buněčné klony MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• Haemophilus influenzae genetika   patogenita   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• sekvence nukleotidů MeSH
• sérotypizace metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• databáze MeSH
• přehledy MeSH
• srovnávací studie MeSH

V laboratořích klinické mikrobiologie jsou stále častěji využívány molekulárně genetické metody (MGM), a to nejen ke správné identifikaci izolovaného původce onemocnění, ale také k jeho přímé, časné detekci v klinickém materiálu. Také v dermatomykologii MGM vhodně doplňují a někdy dokonce nahrazují klasické, časově a odborně náročné diagnostické postupy, založené zejména na přímé mikroskopii a kultivaci. Výhodou MGM je především vysoká citlivost a rychlost detekce agens, které je možné prokázat v řádu několika hodin až dnů. To může napomoci časnému zahájení cílené léčby, nebo naopak zabránit zbytečnému zatěžování pacienta antimykotiky. MGM určené pro přímou detekci mikromycet nám však i přes značný pokrok stále nezaručují jejich přesnou identifikaci. K tomuto účelu je stále třeba patogen nejprve izolovat, poté je možné využít některých dalších MGM k jeho určení. Cílem tohoto přehledového článku je shrnout možnosti využití MGM pro přímou detekci dermatofytů z klinických vzorků, dále pro identifikaci druhů a typizaci kmenů. Klíčová slova: molekulárně genetické metody – dermatofyty – dermatomykózy – detekce – identifikace – typizace

The molecular genetic methods (MGM) are used frequently in clinical microbiology to identify the agent of infection and also to its early direct detection in clinical specimens. In dermatomycology MGM supply or even substitute the classic time consuming and sophisticated diagnostic methods based on direct microscopy and cultivation. The high sensitivity and rapid agent detection available in few hours or days is an advantage of MGM that enables to start the early targeted therapy or to avoid an unnecessary antifungal treatment. However MGM designated to direct micromycetes detection does not guarantee their precise diagnostics which still requires the pathogen isolation before MGM are used to its identification. Article reviews the possibilities of MGM use in direct dermatophytes detection from clinical specimens and in species and strains identification. Key words: molecular genetic methods – dermatophytes – mycosis – detection – identification – typization

• Klíčová slova
• dermatofyty,
• MeSH
• dermatomykózy * diagnóza   MeSH
• DNA fingerprinting * metody   MeSH
• DNA fungální MeSH
• DNA primery diagnostické užití   MeSH
• houby * genetika   izolace a purifikace   MeSH
• lidé MeSH
• Microsporum genetika   izolace a purifikace   MeSH
• mikrosatelitní repetice genetika   MeSH
• molekulární typizace metody   MeSH
• multilokusová sekvenční typizace MeSH
• mykologické určovací techniky metody   MeSH
• polymerázová řetězová reakce * metody   MeSH
• sekvenční analýza DNA * MeSH
• Trichophyton genetika   izolace a purifikace   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Typizace lidských leukocytárních antigenů HLA I.třídy na DNA úrovni pomocí metody založené na amplifikaci polymorfního systému (PCR-SSP,-ARMS) u dárců a příjemců pro transplantace orgánů i kostní dřený.; Human Leukocyte Antigen (HLA) Class I typing at the level of DNA using a method based on polymorphic system amplification (PCR-SSP, -ARMS) in donors and recipients in organ and bone marrow transplantation.

• MeSH
• DNA izolace a purifikace   analýza   MeSH
• HLA antigeny MeSH
• polymerázová řetězová reakce využití   metody   MeSH
• sérotypizace MeSH
• transplantační imunologie MeSH

• Konspekt
• Patologie. Klinická medicína
• NLK Obory
• transplantologie
• alergologie a imunologie
• biologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR